表面增強拉曼散射技術(shù)在蛋白質(zhì)類物質(zhì)檢測中的研究進展

韓子，郭曉東，王元鳳，魏新林*

1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院（上海 200240）；2.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（上海 200234）

蛋白類物質(zhì)的檢測被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷、食品及環(huán)境檢測等領(lǐng)域。其常用的檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）[1]、電化學(xué)[2]、基于熒光的蛋白質(zhì)微陣列[3]等。然而，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)檢測方法需要消耗大量材料，操作復(fù)雜、產(chǎn)量低，影響在實際檢測中的應(yīng)用[4]。

拉曼散射現(xiàn)象推動檢測技術(shù)的革新，但較弱的拉曼效應(yīng)及低靈敏度阻礙其大規(guī)模發(fā)展；表面增強拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）技術(shù)的發(fā)現(xiàn)在增強拉曼信號方面提供了新的解決思路。SERS技術(shù)基于貴金屬的聚集效應(yīng)，將待測分子吸附在納米級粗糙金屬表面，使得入射光激發(fā)金屬表面電子產(chǎn)生更強烈的共振，極大地增強了拉曼信號[5]。隨著研究日益深入，SERS技術(shù)成為小分子、大分子蛋白質(zhì)甚至細胞生物分子分析必不可少的超靈敏分析工具，它可以通過分子的拉曼指紋圖譜實現(xiàn)對待測分子的無標記檢測[6]。對SERS技術(shù)的發(fā)展及原理進行概述，對SERS及其聯(lián)用技術(shù)在蛋白質(zhì)類物質(zhì)檢測中的應(yīng)用進行介紹，為建立基于SERS的蛋白質(zhì)檢測方法提供參考。

1 拉曼散射、表面增強拉曼（SERS）光譜及SERS基底

1928年，拉曼等[7]發(fā)現(xiàn)散射光波長相對于入射光發(fā)生改變，該現(xiàn)象因此被命名為“拉曼散射”。由于拉曼散射是入射光子（h）的非彈性散射，能夠因其特征分子振動的能量而在頻率上發(fā)生位移（圖1a）；依據(jù)散射后波長的增加或降低，可分為斯托克斯散射（h1）和反斯托克斯散射（h2）[8]。1974年，F(xiàn)leischmann等[9]發(fā)現(xiàn)粗糙銀電極上吡啶產(chǎn)生的拉曼信號有所增強的現(xiàn)象，即表面增強拉曼散射（SERS）。其原理圖如圖1（b）所示。SERS效應(yīng)產(chǎn)生的原理被認為是由電磁增強和化學(xué)增強介導(dǎo)的[10]。電磁增強理論認為，入射光可以激發(fā)納米金屬表面的電子產(chǎn)生局域表面等離子體共振（LSPR）；而化學(xué)增強（電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)）機制具有一定的限制性，只適用于能與金屬表面形成化學(xué)鍵的物質(zhì)[11]。材料的尺寸、形狀、顆粒間距及介質(zhì)環(huán)境均會影響LSPR強度[12]進而影響SERS效應(yīng)，因此，選擇合適的SERS基底尤為重要。

圖1 拉曼散射的原理[13]（a）和表面增強拉曼散射（SERS）的原理[14]（b）

為擴大表面增強拉曼光譜技術(shù)的應(yīng)用規(guī)模，該技術(shù)的靈敏度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、基底成本和制造的簡易性等問題亟待解決[15]。SERS活性納米的結(jié)構(gòu)由2種類型的基質(zhì)組成：基于固體表面的基質(zhì)和基于膠體的基質(zhì)[16]。固相的SERS基底有助于制備高度增強信號的表面金屬納米結(jié)構(gòu)，如將納米顆粒直接沉積在氨基硅烷涂層表面或利用納米光刻技術(shù)、電子束光刻技術(shù)等制備納米三角陣列或納米球[17]；金或銀的納米顆粒液相體系也是常用的SERS基底，與固態(tài)基底相比表現(xiàn)出了更好的分散均勻性[18]。基于對固相及液相SERS基底的改進將有助于開發(fā)檢測性能更高的SERS技術(shù)。

作為一種強大的分析及成像工具，SERS圖譜可以提供更加豐富的振動光譜信息，使其在食品分析、藥物分析、生物醫(yī)學(xué)方面獲得廣泛應(yīng)用[19-25]。根據(jù)檢測方法的不同，基于SERS的蛋白檢測可以分為兩類，一類是SERS直接檢測法，另一類是基于SERS的聯(lián)用技術(shù)。

2 SERS直接檢測技術(shù)

直接法是SERS中最簡單常用的方法，可獲取與等離子體材料直接接觸的目標分析物的SERS光譜，同時能獲取蛋白質(zhì)振動光譜中的信息；該種方法靈敏度高，某些情況下甚至可以檢測到單分子[26]。

通過SERS檢測蛋白質(zhì)的策略是基于目標蛋白存在條件下貴金屬膠體的化學(xué)或物理聚集，納米簇聚集產(chǎn)生的交互效應(yīng)可以產(chǎn)生較高的電場強度，這些以高電場強度聚集的局部區(qū)域被稱為“熱點”[27]。貴金屬納米粒子因具備良好的等離子體共振效應(yīng)及易于調(diào)諧的幾何學(xué)性質(zhì)，能夠提供豐富的“熱點”，常被用于基于SERS技術(shù)的檢測。Chen等[28]開發(fā)金納米棒（Au NR）修飾的氧化石墨烯作為底物，以裸露的Au NRS為探針的新型夾心免疫結(jié)構(gòu)為SERS基底，用于腫瘤標志物癌胚抗原（CEA）的定量檢測；受到化學(xué)和電磁增強的共同作用，檢測限可達3.01 pg/mL。在SERS直接檢測中，納米粒子的尺寸和拉曼照明波長能夠影響金納米粒子及納米等離子體團簇，因而可以通過調(diào)整光照波長及選擇合適的金納米團簇模型，防止輻射損耗，進一步優(yōu)化SERS對蛋白質(zhì)的檢測[29]。

圖2 SERS直接檢測技術(shù)示意圖

3 基于SERS的聯(lián)用檢測技術(shù)

基于SERS的蛋白質(zhì)直接檢測方法發(fā)展較為成熟，但仍需要昂貴的試劑和儀器，費時費力，需要訓(xùn)練有素的操作人員等。隨著SERS發(fā)展，許多傳統(tǒng)的檢測蛋白質(zhì)類的方法，如酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫印跡法（MIP），在單獨使用時往往操作復(fù)雜、穩(wěn)定性和重復(fù)性不強、干擾因素多、成本高[30]，不適用于基質(zhì)復(fù)雜的樣品等，當(dāng)與SERS聯(lián)用時，將會表現(xiàn)出更好的檢測能力。同時，隨著近年來對臨場檢測及快速檢測的要求，SERS與試紙條及生物芯片的聯(lián)用也成為基于SERS的檢測蛋白質(zhì)類物質(zhì)的新型手段。

3.1 SERS與酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）聯(lián)用

ELISA是一種定量分析方法，通過酶連接的偶聯(lián)物和酶底物之間相互作用所產(chǎn)生的顏色變化來表現(xiàn)抗原-抗體反應(yīng)[31]。傳統(tǒng)的ELISA所用抗原及抗體的制備成本高，質(zhì)量易受抗原抗體制備方法的影響[32]，需要較為精密的操作，具有一定的局限性。

通常情況下，檢測抗體和拉曼報告分子標記在納米粒子表面形成免疫拉曼探針，當(dāng)免疫拉曼探針與抗原結(jié)合時，可通過檢測拉曼信號來確定抗原濃度[33]。由于蛋白質(zhì)是一類大分子物質(zhì)，在基于SERS的ELISA檢測法中，“三明治”模式是最常見的一種（圖3A）。Yang等[34]制備一種新型的等離子體多層核殼的-衛(wèi)星納米結(jié)構(gòu)（Au@Ag@SiO2-AuNPs），Au@Ag作為SERS平臺，較高的SiO2層在Au@Ag與AuNPs之間表現(xiàn)出遠程等離子體耦合，進一步導(dǎo)致了拉曼散射增強。此外，還可以利用過氧化氫的還原性來改變金屬納米顆粒以實現(xiàn)超靈敏檢測。Liang等[33]結(jié)合SERS和銀納米粒子聚集，ELISA的酶標物質(zhì)通過控制過氧化氫對拉曼標記銀納米顆粒的溶解，實現(xiàn)抗原-抗體反應(yīng)，同時，該過程在分析物存在時產(chǎn)生較強的拉曼信號。

3.2 SERS與免疫印跡技術(shù)

分子印跡聚合物（MIP）具有特定的識別能力，穩(wěn)定性好、制備簡單、成本低，與SERS聯(lián)用時不需要特殊的標記，因而具備廣泛的應(yīng)用前景。如圖3（B）所示，MIP材料可作為待測目標蛋白的預(yù)濃縮方法，在SERS標簽即金屬納米粒子和拉曼信號分子的作用下，通過抗體與抗原特異性結(jié)合以獲得SERS信號[35]。有研究表明，結(jié)合MIP可以捕獲糖蛋白、包括SERS報告基因的金屬NPs以及硼酸基結(jié)合到蛋白質(zhì)的糖基化部分來實現(xiàn)蛋白質(zhì)檢測[36]。Tu等[37]采用金基硼酸鹽親和分子印跡技術(shù)從復(fù)雜樣品中特異性提取目標糖蛋白，金陣列在激光照射下產(chǎn)生等離子體波，顯著增強SERS信號，分析時間可以縮短至30 min。MIP方法操作較為復(fù)雜，定量分析不夠精確，通過與SERS聯(lián)用能夠依靠特征性指紋圖譜獲得更為精確的蛋白質(zhì)定性定量指標，有助于進一步分析鑒定。

3.3 SERS與試紙條聯(lián)用

試紙條是一種快速簡便的現(xiàn)場檢測手段，但通常僅作為一種定性或半定量測量的工具，其靈敏度和穩(wěn)定性仍有待提高。功能化的Fe3O4@Au磁性納米顆粒（MNPs）可對雙重感染生物標記物進行超靈敏分析，而經(jīng)抗體修飾的Fe3O4@Au MNP能夠作為SERS納米標記感染生物標記物，組裝在側(cè)向流免疫層析試紙條時，可實現(xiàn)血液中目標感染生物標志物的定量檢測（如圖3C所示）[38]。Wang等[39]利用Fe3O4@Ag磁標簽與雙層拉曼分子和捕獲目標病毒的抗體結(jié)合，可對試紙條上的目標病毒進行特異性識別和富集，對甲型H1N1流感病毒和人腺病毒（HAV）的檢出限可分別達到50和10 PFU/mL。紙基試紙條結(jié)合SERS同樣可以實現(xiàn)待測物的快速、靈敏定量分析。有研究表明，將具備多個“熱點”的樹莓型雙金屬Au@AgNP納米結(jié)構(gòu)組裝在箭頭形試紙條上，可以實現(xiàn)對復(fù)雜樣品的高靈敏度檢測，且樹莓型的雙金屬納米粒子SERS性能的靈敏度和穩(wěn)定性均優(yōu)于球形AgNP[40]。引入SERS技術(shù)可極大地提高試紙條的定量檢測及分析的可靠性和靈敏度，有利于實現(xiàn)LFIA的痕量蛋白質(zhì)檢測。

3.4 SERS與生物芯片聯(lián)用

生物傳感器可對蛋白質(zhì)類物質(zhì)進行定量檢測，靈敏度較高，選擇性好，適用于現(xiàn)場分析。與生物芯片聯(lián)用SERS基底通常是使用刻蝕工藝將模板圖案轉(zhuǎn)移到人IgG底物上，芯片暴露于等離子體后洗去納米顆粒，將其浸入牛血清白蛋白溶液中，獲得圖案化的蛋白質(zhì)芯片，用于蛋白質(zhì)檢測時，將上述芯片浸入標記抗原溶液中即可完成檢測[41]。如圖3（D）所示，一般而言，有序排列的硅納米管（SiNPLs）和等離子體銀納米顆粒（AgNPs）可作為增強SERS信號的有效基底，適用于不同帶電蛋白質(zhì)甚至特殊的淀粉樣蛋白[42]。然而，對于SERS與生物芯片聯(lián)用的報道較少，大部分仍集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

圖3 SERS與ELISA（A）、免疫印跡（B）、試紙條（C）、生物芯片（D）技術(shù)聯(lián)用原理圖

4 結(jié)語及展望

SERS技術(shù)觀察到的拉曼信號比傳統(tǒng)的拉曼散射高幾個數(shù)量級，能有效降低使用熒光標記產(chǎn)生的光淬滅及干擾現(xiàn)象，并能夠通過選擇合適的SERS基底實現(xiàn)信號放大，提高對蛋白質(zhì)類物質(zhì)檢測的靈敏度。隨著SERS與越來越多的技術(shù)聯(lián)用，基于SERS的蛋白質(zhì)類物質(zhì)檢測的應(yīng)用范圍逐漸從醫(yī)學(xué)領(lǐng)域拓寬到環(huán)境檢測、食品等領(lǐng)域。

然而，仍有許多技術(shù)問題亟待解決。SERS技術(shù)應(yīng)用的瓶頸問題是待檢測的分析物附著的有效“熱點”很少；拉曼基底隨機分布在SERS基底上，導(dǎo)致SERS信號的重現(xiàn)性通常不佳；不均勻的SERS活性底物影響SERS定量分析的準確性；不能同時檢測樣品中的多種蛋白質(zhì)；SERS基底通常是一次性的，不利于對待測物質(zhì)的反復(fù)捕獲和釋放[43]。

針對上述問題，可將目標聚焦于構(gòu)建高密度、均勻分布的“熱點”，實現(xiàn)“熱點”內(nèi)拉曼分子的有效富集。隨著檢測技術(shù)的日益完善及更靈敏便捷的檢測方法不斷發(fā)展，基于SERS的檢測技術(shù)可在醫(yī)學(xué)、環(huán)境、食品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。