生馬鈴薯通過酶法脫支制備抗性淀粉

王六強，張新武，孔紅建，王楊，張嬌嬌

河南省食品工業(yè)科學研究所有限公司，鄭州市抗消化淀粉生產(chǎn)技術(shù)與應用重點實驗室（鄭州 450053）

淀粉是自然界中非常富裕的能量資源，特別是在人們生活中有著重要作用和需求。長期以來，淀粉被認為可以被人體完全消化和吸收，然而，20世紀80年代，英國生理學家Flan Englystt在研究中發(fā)現(xiàn)在被包埋的不溶性膳食纖維中含有淀粉成分，并稱之為Resistant starch，簡稱RS，即抗性淀粉。在隨后的試驗中發(fā)現(xiàn)，從加工食品中分離出的某些常見的淀粉，無法在人工模擬消化環(huán)境中被淀粉酶水解，至此，抗性淀粉的研究引起國外學者的關(guān)注。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）1990年的定義，抗性淀粉指的是“健康者小腸中不吸收的淀粉及其降解產(chǎn)物”，但能在大腸中發(fā)酵的淀粉及其淀粉降解物的總稱[1]。抗性淀粉的化學性質(zhì)還沒有較為明確的分類，但根據(jù)淀粉的來源和試驗性質(zhì)分析，可將其分4個類別，分別為RS1（物理包埋淀粉）、RS2（抗性淀粉顆粒）、RS3（老化淀粉）、RS4（化學改性淀粉）[2]。

在食品加工中，抗性淀粉具有特殊的生理功能和特性，可作為食品加工輔助產(chǎn)品，適合用于制造高品質(zhì)食品，在生物行業(yè)、醫(yī)學行業(yè)、食品加工行業(yè)引起廣泛關(guān)注[3]。如食品加工中，在低水分的食品中添加普通的膳食纖維，會使得食品的口感、品質(zhì)下降，而抗性淀粉的作用與膳食纖維類似，但又比膳食纖維具有更出色的生理功能，不但不影響食品的口感和品質(zhì)，還能使食品的口感更佳酥脆，使食品具有更加出色的蓬松性[4]。在醫(yī)學行業(yè)，抗性淀粉被食用后，可以直接進入人體的小腸里分解，產(chǎn)生大量脂肪酸，對保持腸道健康和預防一些血糖疾病等有重要作用[5-6]。人體健康與碳水化合物的關(guān)系密不可分，因此抗性淀粉具有重要的研究價值和意義。

抗性淀粉的制備主要分為物理法、化學法和酶法改性3種。其中，物理法、化學法具有不同程度的缺點。如化學法中主要采用酸水解法，其脫支作用專一性差，并且酸堿試劑在后續(xù)產(chǎn)品處理中更加麻煩，存在一定污染問題[7]。酶法脫支可分為均相脫支和異相脫支，前者是淀粉在高溫糊化后加入酶，降溫脫支處理；后者是不經(jīng)過糊化的淀粉，在較低溫度下進行部分脫支處理[8]。普魯蘭酶可在水解過程中切斷支鏈淀粉中的α-1, 6糖苷鍵，是水解產(chǎn)物中含有更多的直鏈分子，耐高溫α-淀粉酶可以適當?shù)厍卸谭肿渔?，將這2種酶結(jié)合使用，可使長度均勻且長度適中的直鏈淀粉在相互重新排列形成抗性淀粉時效率更高，最終得率得到極大提升[9]。與物理化學方法相比，酶法脫支具有能耗少、成本低、效率高、更加綠色無污染等優(yōu)點，制備食品更加安全衛(wèi)生，因此受到廣泛關(guān)注。

試驗以新鮮馬鈴薯為原料，以抗性淀粉得率為考察目標，研究耐高溫α-淀粉酶用量和作用時間，以及普魯蘭酶用量、作用時間、作用溫度等多種因素對抗性淀粉制備得率影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上后，設(shè)計正交試驗來分析最佳工藝條件，以期提高抗性淀粉得率[10]。試驗為抗性淀粉的制備和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

新鮮馬鈴薯（市售）；耐高溫α-淀粉酶、普魯蘭酶（諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司）；胃蛋白酶溶液、葡萄糖淀粉酶（河南仰韶生化工程有限公司）；抗性淀粉檢測試劑盒（愛爾蘭Megazyme公司）；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

YXQ-LS-100A型立式壓力滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）；TDZ5-WS臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；SHA-C型恒溫振蕩器（常州智博瑞儀器制造有限公司）；DHGT-9053A型鼓風干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；723N型分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；HR1844型破碎機（珠海經(jīng)濟特區(qū)飛利浦家庭電器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 馬鈴薯抗性淀粉制備工藝

馬鈴薯抗性淀粉的制備方法參考李珊珊等[12]方法，并加以改良。

1.3.2 抗性淀粉含量測定方法

抗性淀粉檢測操作采用AOAC-GOPOD法[13]。準確稱取100 mg樣品，加入4.0 mLα-胰淀粉酶，于37 ℃振蕩16 h，加入4.0 mL無水乙醇，離心10 min，收集上清液，沉淀用50%乙醇洗滌3次，合并上清液，沉淀水浴，加入2 mL 2 mol/L的KOH，磁力攪拌，加入8 mL 1.2 mol/L的醋酸鈉緩沖溶液，混勻，加入0.1 mL AMG，于50 ℃水浴30 min。RS含量＜10%時，將處理后溶液直接離心；RS含量＞10%時，根據(jù)抗性淀粉的含量定容溶液，取少量溶液離心。用GOPOD法測定還原糖的含量?？剐缘矸酆繛檫€原糖含量×0.9。

1.3.3 單因素試驗

單因素試驗在耐高溫α-淀粉酶用量3 NU/g、作用時間30 min；普魯蘭酶用量5 NPUN/g、作用時間8 h、作用溫度60 ℃基礎(chǔ)上，變換相應因素水平：耐高溫α-淀粉酶用量（1，3，5，7和9 NU/g）；耐高溫α-淀粉酶作用時間（10，20，30，40和50 min）；普魯蘭酶用量（2，4，6，8和10 NPUN/g）；普魯蘭酶作用時間（2，6，10，14和18 h）；普魯蘭酶作用溫度（50，55，60，65和70 ℃），按照抗性淀粉的制備方法，考察不同因素對抗性淀粉得率的影響。

1.3.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行五因素四水平的正交試驗分析，選取的5個因素，分別為耐高溫α-淀粉酶用量和作用時間，以及普魯蘭酶用量、作用時間、作用溫度。設(shè)計水平安排見表1。

表1 正交試驗方案設(shè)定

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗的結(jié)果與分析

2.1.1 耐高溫α-淀粉酶用量對抗性淀粉得率的影響

由圖1所示，在單因素試驗中，耐高溫α-淀粉酶用量較少時，抗性淀粉得率受到較大影響，耐高溫α-淀粉酶用量3 NU/g時，得率達到最高，為10.1%，而超過3 NU/g時，得率又略有下降。分析認為，酶量的多少決定了切割淀粉的程度，酶量大時，直鏈分子被酶切太短，不利于分子間重新結(jié)合形成所需淀粉分子，酶量過小時，直鏈分子酶切不夠完全，達不到較好的切割效果，同樣不利于抗性淀粉形成。

圖1 耐高溫α-淀粉酶用量對抗性淀粉得率的影響

2.1.2 耐高溫α-淀粉酶作用時間對抗性淀粉得率的影響

由圖2所示，在單因素試驗中，隨著耐高溫α-淀粉酶作用時間增加，抗性淀粉得率先增大后減小，耐高溫α-淀粉酶作用時間30 min時，抗性淀粉得率達到最高，為10.08%。分析認為，耐高溫α-淀粉酶切割淀粉分子需要一定作用時間，時間過短，淀粉分子水解程度不夠，切割成的分子鏈過長，不易形成抗性淀粉，時間過長時會將分子鏈切得太短，使得分子運動過快，也不利于形成抗性淀粉。

圖2 耐高溫α-淀粉酶作用時間對抗性淀粉得率的影響

2.1.3 普魯蘭酶用量對抗性淀粉得率的影響

由圖3所示，在單因素試驗中，普魯蘭酶用量對抗性淀粉的得率存在一定程度的影響。普魯蘭酶用量少于4 NPUN/g，隨著用量增大，抗性淀粉得率明顯增大，而之后抗性淀粉得率逐漸下降。普魯蘭酶用量4 NPUN/g時，抗性淀粉得率為10.02%。分析認為，普魯蘭酶對抗性淀粉的最佳脫支效果存在一定上限。抗性淀粉的脫支效果已達到要求，繼續(xù)進行脫支酶解，直鏈分子再次被切割為更小的淀粉分子，分子聚合度過低，不利于重新結(jié)晶形成抗性淀粉。

圖3 普魯蘭酶用量對抗性淀粉得率的影響

2.1.4 普魯蘭酶作用時間對抗性淀粉得率的影響

由圖4所示，在單因素試驗中，普魯蘭酶作用時間過長或過短，均會使抗性淀粉的得率降低，作用時間10 h左右時，抗性淀粉得率達到最高，為9.82%。分析認為酶作用需要一定時間，作用時間延長，會使酶切割更多分子，從而影響抗性淀粉形成。

圖4 普魯蘭酶作用時間對抗性淀粉得率的影響

2.1.5 普魯蘭酶作用溫度對抗性淀粉得率的影響

由圖5所示，普魯蘭酶作用溫度55 ℃左右時，抗性淀粉的得率達到最高，為10.24%，且作用溫度升高或降低均對得率均存在較大影響。分析認為，酶的活性受到溫度的影響較大：溫度低，則酶的活力不足，不能充分水解支鏈上的α-1, 6-糖苷鍵；溫度過高，部分酶失去活性，也不利于抗性淀粉形成，只有在酶最佳作用溫度下，可以達到最好脫支效果。

圖5 普魯蘭酶作用溫度對抗性淀粉得率的影響

2.2 正交試驗的結(jié)果與分析

通過表2正交試驗結(jié)果可知，最優(yōu)水平組合為A2B3C2D3E2，即耐高溫α-淀粉酶用量3 NU/g、作用時間30 min；普魯蘭酶用量4 NPUN/g、作用時間10 h，作用溫度55 ℃。在此條件下制備抗性淀粉，通過3組平行試驗，由表3可知，抗性淀粉得率為10.45%±0.03%，比較正交試驗其他組合，則最優(yōu)組合得率最高。通過極差分析可知，各因素對抗性淀粉制備條件影響大小為耐高溫α-淀粉酶用量＞普魯蘭酶作用時間＞普魯蘭酶作用溫度＞耐高溫α-淀粉酶作用溫度＞普魯蘭酶用量。

表2 正交試驗方案及結(jié)果

表3 驗證試驗結(jié)果 單位：%

分析認為，耐高溫α-淀粉酶和普魯蘭酶分別屬于內(nèi)切酶和異淀粉酶，主要起切割糖苷鍵作用。支鏈淀粉中的α-1, 6糖苷鍵被切開，有利于得到更多的直鏈分子；同時，α-1, 4糖苷鍵的斷開，使直鏈淀粉長度更加平均，有利于分子間的重新排列形成抗性淀粉，使其產(chǎn)率得到極大提高。由抗性淀粉制備原理可知，抗性淀粉主要是由于直鏈淀粉凝沉作用產(chǎn)生的，直鏈淀粉的含量對抗性淀粉的形成有顯著影響，因此，直鏈淀粉分子含量越高，越有利于淀粉分子相互結(jié)合形成抗性淀粉。耐高溫α-淀粉酶的作用可以適當?shù)厍卸谭肿渔?，產(chǎn)生長度均勻適中的淀粉分子鏈，普魯蘭酶的作用可以切割α-1, 6葡萄糖苷鍵，從而在淀粉水解時產(chǎn)生更多的直鏈淀粉，有利于分子重新凝結(jié)。因此耐高溫α-淀粉酶和普魯蘭酶聯(lián)合作用，直接影響到抗性淀粉形成。通過正交試驗結(jié)果可以得出抗性淀粉得率的最佳條件，通過結(jié)果對比可以看出，耐高溫α-淀粉酶用量是其中最重要的影響因素[14]。

3 結(jié)論與討論

針對不同種類的抗性淀粉，國內(nèi)外學者采取多種方法制備，在英國和美國有相應的抗性淀粉產(chǎn)品進行工業(yè)化生產(chǎn)，但新技術(shù)創(chuàng)新較少，且大多數(shù)研究應用基于非顆粒性RS3，其他種類的商品化生產(chǎn)和應用較少。國內(nèi)食品行業(yè)對于抗性淀粉的研究相對較少，起步較晚，有較大的研究發(fā)展空間[15]。

酶法脫支是一種制備抗性淀粉的有效方法，對淀粉性質(zhì)產(chǎn)生不同作用。通過正交試驗對制備抗性淀粉工藝進行優(yōu)化，確定最優(yōu)工藝條件：耐高溫α-淀粉酶用量3 NU/g、作用時間30 min；普魯蘭酶用量4 NPUN/g、作用時間10 h、作用溫度55 ℃。在此條件下，抗性淀粉得率為10.45%±0.03%。其中，耐高溫α-淀粉酶用量是抗性淀粉形成的重要條件，在最佳條件下，抗性淀粉得率顯著增加。試驗為國內(nèi)抗性淀粉加工技術(shù)和工藝優(yōu)化提供參考。

21世紀以來生活水平得到極大提高，飲食更佳豐富美味，但隨之而來的糖尿病、高血壓、高脂肪等現(xiàn)代病逐漸困擾越來越多的人群，健康觀念得到普遍重視。因此，開發(fā)推廣健康、綠色安全的新型食品，對健康飲食具有重大意義?？剐缘矸蹚浹a普通膳食纖維的缺點，在功能性食品的生產(chǎn)和應用中有重要研究價值和廣闊發(fā)展前景，特別是對健康生活具有重要作用[16]。