海參多肽微丸制備工藝

胡越，繆怡燁, ，喻樊, *，戚嘉怡，鄭嘉瑤，劉岐

1.鹽城師范學院藥學院（鹽城 224051）；2.江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護重點建設實驗室（鹽城 224002）；3.南京工業(yè)大學（南京 210000）；4.揚州大學醫(yī)學院（揚州 225001）

海參，屬海參綱動物，其主要的功效成分是海參多肽、海參多糖等[1]。海參多肽是一種生物活性多肽，具有抗氧化、延緩衰老等功能[2-3]。近年來，海參多肽的抗氧化性得到越來越多的關注。

微丸是一種直徑為0.5～2.5 mm的球形或是類球形的多單元新型口服制劑，單次給藥量可高達幾十甚至幾百顆，優(yōu)于片劑、丸劑等固體制劑。由于擠出滾圓法制備的微丸顆粒直徑一致，活性成分的含量均勻，可用于大生產(chǎn)，是常用的制備微丸的方法之一[4]。市面上銷售的保健品多是海參肽營養(yǎng)粉和海參干粉等，未見海參多肽微丸。該文評價了海參多肽的抗氧化性，并對擠出滾圓法制備海參多肽微丸的工藝進行了探討。

1 材料

1.1 設備與儀器

E-50擠出制粒機，R-250離心滾圓機（重慶英格制藥設備制造有限公司），冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司，F(xiàn)D-1D-80），紅外光譜儀（德國布魯克BRUKER TENSOR II傅里葉紅外光譜儀），掃描電子顯微鏡（FEI，QUANTA200）。

1.2 試劑

淡干海參（煙臺瑞參堂水產(chǎn)有限公司），微晶纖維素（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160802），木瓜蛋白酶（上海藍季生物，≥1 000 U/mg），1, 1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH，上海藍季生物），焦性沒食子酸（鄰苯三酚，上海展云化工有限公司，批號：161010），三羥甲基氨基甲烷（Tris，上海藍季生物），其他試劑為分析純。

2 試驗方法

2.1 空白微丸制備

采用擠出滾圓法制備微丸。利用單因素試驗方法[5]，以圓整度為主要指標，研究最佳微丸制備工藝。

空白微丸處方：50 g碳酸鈣，12.5 g微晶纖維素，適量10%淀粉漿。

2.2 海參多肽的制備

2.2.1 海參的處理

將海參用純水浸泡，于4 ℃回軟。將海參開膛去除沙嘴和內(nèi)臟。放入沸水中煮70～90 min。海參4 ℃冰箱中純水浸泡3 d，每12 h換水。處理好后的海參剪成約2 cm的薄片，冷凍干燥。

2.2.2 海參多肽水解時間

稱取0.2 g海參粉，加入150 mL純水，調(diào)節(jié)pH為8.0，稱取12%木瓜蛋白酶[6]，即0.024 g，于55 ℃水浴加熱，以5 000 r/min離心10 min，取上清液在280 nm處測量水解液的吸光度，計算得率并記錄。

2.2.3 紫外吸收標準曲線

精密稱取牛血清白蛋白，制備2 mg/mL的儲備液。精密量取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL的儲備液于試管中，去離子水補足至1 mL，再精密量取4 mL的雙縮脲試劑，充分搖勻，于25 ℃水浴30 min，取出，在540 nm下測定吸光度。其標準曲線方程為y=0.044 2x+0.000 9（R2=0.999 3）。

2.2.4 水解度

用移液管移取5 mL水解液，再加入5 mL 10% TCA溶液，振蕩混合均勻，靜置10 min，以4 000 r/min離心20 min，在540 nm處測定吸光度A1。再加入5 mL去離子水，于55 ℃水浴加熱若干小時，重復上述步驟，得吸光度A2?？偟鞍譔0用微量凱氏定氮法，N1和N2采用標準曲線法[7]。

式中：N0為海參粉中的總蛋白濃度；N1為酶解前水解液中的可溶性蛋白濃度；N2為酶解后水解液中的可溶性蛋白濃度。

2.2.5 收率

水解液在100 ℃沸水中鈍化酶活性10 min[8]，以4 000 r/min離心15 min收集上清，凍干燥，計算收率。

式中：m0為海參粉的總質(zhì)量；m1為冷凍干燥好的海參多肽的總質(zhì)量。

2.2.6 海參多肽的性質(zhì)

2.2.6.1 DPPH·清除率[9]

避光精密稱取0.009 8 g DPPH·，用無水乙醇定容于250 mL棕色容量瓶中。稱取0.050 0 g海參多肽定容于10 mL的容量瓶中，作為樣品溶液。分別移取不同體積的樣品溶液，用去離子水補足至2 mL，再加入2 mL的DPPH溶液，充分搖勻后，避光反應30 min，以去離子水作為參比溶液，在517 nm處測定溶液的吸光度，為Aj。同時樣品溶液加入2 mL的無水乙醇，作為空白對照Ai，2 mL的去離子水和2 mL的DPPH溶液的吸光度為A0。清除率按式（3）計算：

2.2.6.2 OH·清除率[10]

稱取0.050 0 g海參多肽定容于10 mL容量瓶中，作為樣品溶液。依次加入1 mL 9 mmol/L的硫酸亞鐵，1 mL 9 mmol/L的乙醇-水楊酸，12 mL去離子水，最后加入1 mL 8.8 mmol/L的過氧化氫，充分搖勻，于37 ℃水浴15 min，離心取上清液，在510 nm處測其吸光度A0，以不加過氧化氫的體系為參比溶液測定Ax0，去離子水為參比溶液測定吸光度Ax。清除率按式（4）計算：

2.2.6.3 O2-·清除率[11]

稱取0.050 0 g海參多肽定容于10 mL容量瓶中，作為樣品溶液。取4.2 mL蒸餾水，4.5 mL的0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.2），混合均勻，在37 ℃下水浴20 min。取3 mL于比色皿中，再移取0.105 mL 3 mmol/L的鄰苯三酚溶液（以10 mmol/L的HCl為空白），混勻，在325 nm下每30 s測定吸光度A0，4 min后停止。樣品液步驟同上，測定吸光度Aj。清除率按式（5）計算：

2.3 海參多肽微丸的制備

處方：10 g碳酸鈣，7.5 g微晶纖維素，0.9 g海參多肽，適量10%淀粉漿。

按處方量制作軟材。將軟材放入擠出滾圓機中，設定擠出頻率30 Hz、滾圓頻率50 Hz、滾圓時間4 min。將微丸放入65 ℃烘箱進行干燥，稱質(zhì)量。

2.4 海參多肽微丸的表征

2.4.1 掃描電子顯微鏡

將海參多肽、空白微丸、海參多肽微丸和在人工胃液中溶蝕0.5，1，2和4 h的海參多肽微丸在掃描電子顯微鏡下進行檢測。

2.4.2 紅外光譜

3 結(jié)果與分析

3.1 制備空白微丸參數(shù)的選擇

固定滾圓頻率50 Hz、滾圓時間4 min，考察擠出頻率對圓整度的影響。由圖1可知，擠出頻率的增加，會導致微丸圓整度下降[12]。因此，最佳擠出頻率是30 Hz。離心滾圓機的滾圓頻率越小，轉(zhuǎn)盤提供的離心力和剪切力越小，條狀軟材不易斷，呈長條狀或者是短圓柱狀，圓整度下降。因此，最佳的滾圓頻率是50 Hz。

圖1 擠出頻率和滾圓頻率對微丸圓整度的影響

由圖2可知，隨著滾圓時間的延長，微丸表面較為濕潤，會粘連環(huán)境中的細粉，微丸的直徑增大，導致圓整度下降。因此，最佳滾圓時間是4 min。

圖2 滾圓時間對微丸圓整度的影響

綜上所述，最佳工藝參數(shù)是擠出頻率30 Hz，滾圓頻率50 Hz，滾圓時間4 min。

3.2 海參多肽水解時間

由圖3可知，在前5 h水解過程中，280 nm處的吸光度顯著提高，5 h后吸光度曲線變得平緩，水解時間確定為9 h。

圖3 不同水解時間海參多肽的吸光度

3.3 水解度

水解時間為9 h，A1=0.005，A2=0.026，N0=185.130 g，N1=170.362 g，N2=27.828 g，算得水解度為90.16%。

3.4 收率

根據(jù)公式（2），算得平均收率為69.50%。

3.5 清除率的測定

圖4和圖5分別為不同濃度的海參多肽對DPPH，OH·和O2-·的清除率，結(jié)果顯示海參多肽具有一定的抗氧化能力。

圖4 海參多肽對OH·和DPPH自由基清除率

圖5 海參多肽對O2-·清除率

3.6 海參多肽微丸的表征

3.6.1 電子掃描顯微鏡

圖6中，A是海參多肽，成片狀卷曲。圖B和圖C分別是通過擠出滾圓法制備的空白微丸和海參多肽微丸。在微觀形態(tài)上，海參多肽微丸形態(tài)較圓整。

圖6 掃描電鏡圖

圖7是海參多肽微丸在人工胃液中分別溶蝕0.5，1，2，4 h的圖片，微丸的表面有明顯溶蝕痕跡，而且程度隨時間加劇，這可能是胃酸與輔料中的碳酸鈣反應的結(jié)果。

圖7 不同時間的微丸溶蝕電鏡圖

3.6.2 紅外光譜

如圖8所示，海參多肽在3 415.64 cm-1處有寬且強的O—H峰。碳酸鈣在1 795.46 cm-1處有C—O伸縮振動峰；1 403.73 cm-1是C—O反對稱伸縮振動峰。微晶纖維素在1 058.10 cm-1是C—O—C吡喃環(huán)骨架振動[13]?？瞻孜⑼柙? 430 cm-1吸收峰是C—O反對稱伸縮振動，顯示空白微丸中含有碳酸鈣；1 060 cm-1左右的吸收峰是C—O—C的吡喃環(huán)骨架振動，顯示空白微丸中含有微晶纖維素。物理混合在1 795.88，873.15和710.84 cm-1各有一個吸收峰，表明物理混合中含碳酸鈣；在1 058.92和2 904.39 cm-1處的峰表明有微晶纖維素；3 419.13 cm-1的寬峰是O—H的振動峰。1 430 cm-1的強吸收峰可能是海參多肽中肽鍵與微晶纖維素中C—O反對稱伸縮振動和O—H的彎曲振動的重疊峰。海參多肽微丸的紅外圖譜與物理混合的圖譜相近，表明海參多肽在輔料中分散均勻。

圖8 紅外光譜

4 結(jié)論

近年來，對于海參多肽的抗氧化性的研究逐漸增加。試驗主要從DPPH·、OH·和O2-·三種自由基的清除率對海參多肽的抗氧化性進行評價。結(jié)果顯示，海參多肽對三種自由基均有清除率，對OH·的清除率較高，海參多肽對DPPH·也有明顯的清除作用。試驗還采用擠出滾圓法制備了海參多肽微丸，采用單因素試驗方法，以圓整度為主要指標，獲得了微丸的最佳工藝參數(shù)。通過掃描電子顯微鏡和紅外光譜對海參多肽微丸進行了表征。采用擠出滾圓法制備的海參多肽微丸，使用碳酸鈣作為主要稀釋劑，降低了成本，可以提高海參多肽的穩(wěn)定性，具有一定的應用價值，在市場上有廣闊的前景。