常用家蠶原種對家蠶微粒子的胚傳特性分析

鄭 寧，董戰(zhàn)旗，2，胡 楠，周 亮，潘敏慧，2

1.家蠶基因組生物學國家重點實驗室 西南大學，重慶 400715；2.農業(yè)農村部蠶桑生物學與遺傳育種重點實驗室 西南大學，重慶 400715

微粒子(Microsporidia)廣泛分布于自然界，是一類專性寄生的單細胞真核生物，可以寄生于脊椎動物和無脊椎動物，是一些動物和經濟昆蟲的常見病原，危害極大[1-2]．由于微粒子還能夠機會性感染具有免疫缺陷的病人，近年來備受關注[3-4]．家蠶微粒子病(pébrine)是一種由家蠶微粒子(Nosemabombycis，Nb)感染、寄生引起的蠶病，傳播方式為食下傳染和胚種傳染，是蠶絲業(yè)的重大威脅之一[5-6]．家蠶微粒子曾給歐洲養(yǎng)蠶業(yè)帶來毀滅性打擊，致使其一蹶不振[7]．因此，在蠶業(yè)生產上家蠶微粒子被定為唯一法定檢疫對象．

在家蠶品種對微粒子的抗性研究中，日本學者谷賢三郎于20世紀30年代就指出不同的家蠶品種對微粒子的抗性存在差異，且這種差異會遺傳給子代[8]．劉仕賢等[9]、張遠能等[10]研究了相關家蠶品種對微粒子的抗性差異，結果表明這種差異有強弱之分，且抗性強的品種可以作為寶貴的育種親本材料．為了充分了解現(xiàn)有實用品種的抗性，徐興耀等[11]研究學者對廣東生產常用的品種進行微粒子抗性研究，結果表明其均對微粒子敏感，屬于易感品種．沈中元等[12]對中系、日系、歐洲系統(tǒng)和多化性系統(tǒng)進行微粒子抗性研究，表明不同系統(tǒng)抗性存在差異，少數(shù)品種間存在極顯著差異．近些年各級蠶業(yè)科研單位及蠶種場均集中力量選育強健、優(yōu)質、高產及易繁等家蠶素材，致使實用品種的原種對微粒子抗性及胚傳規(guī)律研究相對較少．目前家蠶微粒子病胚種傳染研究主要問題集中在以下3個方面：① 當前微粒子防控主要通過藥物消毒手段，難以從源頭切斷微粒子傳播；② 對微粒子抗性研究目前主要集中于育種素材方面，對生產的指導意義不大[13]；③ 現(xiàn)有實用品系微粒子抗性不強，導致無法實施針對性防控微粒子．因此結合目前成品卵檢疫標準，迫切需要分析生產過程中家蠶常用實用品系對微粒子的抗性．

為了進一步了解當前生產過程中常用家蠶原種對微粒子的抗性差異，本文利用8個家蠶常用原種對微粒子胚傳特性進行研究，以期分析家蠶原種抗微粒子的規(guī)律，進一步創(chuàng)新發(fā)展家蠶微粒子病防控技術體系．本研究一方面有助于確定微粒子具體檢驗標準，進一步為家蠶微粒子病的風險評估和檢測防控奠定理論基礎，另一方面為篩選高抗性低胚傳的家蠶實用品系提供新的思路．

1 材料與方法

1.1 家蠶微粒子與家蠶品系

家蠶微粒子CQ1分離株，由西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室分離，保存于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)，保藏號CVCC102059．供試家蠶品系為871和872(四川省農業(yè)科學院蠶業(yè)研究所提供)、芙蓉932和湘753(廣西蠶業(yè)推廣總站提供)、菁松B×A和皓月B×A(重慶市蠶業(yè)科學研究院提供)、蘇菊(江蘇大學提供)、云7(云南省農業(yè)科學院蠶蜂研究所提供)，蠶種確認均未感染家蠶微粒子病．

1.2 方 法

1.2.1 帶毒母蛾的準備

3齡起蠶添食含有新鮮家蠶微粒子的桑葉，添食劑量為104個/頭蠶．取感染后5齡4 d幼蟲的絲腺進行勻漿離心，差速離心法獲得家蠶微粒子粗提液，再以不連續(xù)的Percoll梯度(25%，50%，75%和100% v/v)10 000 g離心20 min后獲得純化孢子[11]．

蠶種經催青后幼蟲在25 ℃用新鮮桑葉飼育，在5齡眠起時添食純化后的家蠶微粒子5×105個/頭蠶，待其化蛹成蛾備用．

1.2.2 母蛾帶毒程度檢測

母蛾產卵后研磨鏡檢，每個樣品觀察10個視野，并統(tǒng)計每個視野中微粒子的數(shù)目，計算其平均值．將母蛾帶毒情況分為4類：平均值<1粒、1～10粒、10～100粒、>100粒，分析比較同一添食濃度下不同家蠶原種母蛾的帶毒程度．

1.2.3 子代感染率和感染強度分析

為研究各家蠶原種中母蛾帶毒與子代帶毒情況的關系，選取8個原種母蛾，分別與不帶毒的雄蛾交配，母蛾產卵后研磨鏡檢，根據(jù)鏡檢結果每個原種選取4種不同的帶毒情況母蛾(單個視野平均微粒子數(shù)目：<1/ 1～10/ 10～100/ >100)，將每種帶毒情況的母蛾每個原種選3頭，隨機鏡檢所產蛾圈孵化的蟻蠶90頭．樣本總量為8×4×3=96組，對單獨設置的檢測組每天取90頭蟻蠶鏡檢，同時檢測每個蛾圈每天的蠶沙是否帶毒，避免二次感染．

子代感染率分析：將二次感染發(fā)生前的蟻蠶逐頭鏡檢，每個樣品統(tǒng)計10個視野，只要有一個視野微粒子>1粒即計為陽性．

子代感染強度分析：將二次感染發(fā)生前的蟻蠶逐頭鏡檢，同樣每個樣品統(tǒng)計10個視野，感染強度按鏡檢時10個視野的平均孢子數(shù)計分(平均值<1粒記1分；1～10粒計2分；10～100粒計4分；>100粒計8分)．

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0 軟件對得到的數(shù)據(jù)進行處理，采用方差分析進行差異顯著性分析(ANOVA分析和Kruskal-Wallis分析)，同時進行兩兩比較(Dunnett T3法和LSD法)．

2 結果與分析

2.1 不同帶毒母蛾的胚傳特征

對8個感染微粒子的家蠶原種子代感染率和感染強度平均水平進行分析發(fā)現(xiàn)，子代感染率及子代感染強度與母蛾帶毒程度呈正比(圖1)．在母蛾帶毒程度分別為<1，1～10，10～100和>100這4種情況時，其子代感染率分別為10.4%，17.7%，47.6%和64.5%，子代感染強度分別為9.5，20，66和100．在4種不同帶毒母蛾情況下子代感染率均值約為35%，子代感染強度均值約為49．當母蛾帶毒情況由<1上升到1～10時，子代感染率和感染強度的變化不明顯，表明低帶毒母蛾對胚傳影響不大．而當母蛾帶毒情況由1～10上升到10～100時，子代感染率和感染強度的變化最明顯，即此時母蛾的帶毒程度對子代帶毒造成的變化最為顯著．雖然帶毒程度相同的原種母蛾胚傳會出現(xiàn)一定的差異，但總體而言高帶毒的原種母蛾胚傳帶毒也相應升高．

圖1 8個家蠶原種感染微粒子胚傳子代平均趨勢分析

2.2 母蛾帶毒<1時對子代感染率和子代感染強度的影響

在母蛾帶毒<1時，各原種間子代的感染率均未超過15%，感染強度均未超過15(圖2)．這些原種的子代感染率之間無顯著差異，但子代感染強度云7與其他原種存在顯著差異．具體表現(xiàn)為：與其他原種相比，云7的子代感染率和子代感染強度均最低，分別為8.9%和4，即云7在極低感染情況下表現(xiàn)出一定的抗性．相較于其他原種，芙蓉932、菁松B×A、皓月B×A抗性較差．但在極低感染情況下，當前生產實用原種間并不存在明顯差異．

2.3 母蛾帶毒1～10時對子代感染率和子代感染強度的影響

相較于母蛾帶毒<1，當母蛾帶毒程度增大為1～10時，子代感染率和子代感染強度均有一定升高(圖3)．云7依舊為相對抗性原種，子代感染率和子代感染強度分別為13.3%和15．其中871的子代感染率有顯著上升，達到和芙蓉932相同的子代感染率，芙蓉932、871與云7存在顯著性差異，表明該帶毒情況下871和芙蓉932胚傳最為嚴重．但此時871的子代感染強度卻低于芙蓉932，且存在顯著性差異，表明母蛾原種的類型也會影響微粒子在子代的增殖，同時也暗示出在尋找家蠶抗性原種中，子代感染強度也是一個重要的參考指標．除此之外，在子代感染強度上，云7、菁松B×A、872及871與皓月B×A、芙蓉932存在顯著性差異．

2.4 母蛾帶毒10～100時對子代感染率和子代感染強度的影響

當母蛾帶毒程度為10～100時，子代的感染率和感染強度均表現(xiàn)出相對一致的趨勢，由低到高分別為蘇菊、872、湘753、云7、871、芙蓉932、皓月B×A和菁松B×A．子代感染率數(shù)據(jù)表明，871、芙蓉932、皓月B×A和菁松B×A與蘇菊、872和湘753具有顯著性差異；其中皓月B×A、菁松B×A與蘇菊、872、湘753和云7在子代感染強度上具有顯著性差異(圖4)．在母蛾帶毒程度<1和1～10時，表現(xiàn)出抗性的原種云7在該帶毒程度下子代感染率和感染強度均低于蘇菊，表明相對抗性原種在母蛾帶毒程度改變時，其子代感染率、子代感染強度也均會改變，表現(xiàn)為不顯著抗微粒子．該帶毒程度下母蛾原種的部分子代間感染率具有顯著性差異，但在子代感染強度上卻表現(xiàn)不明顯．

字母a，b代表差異原種，含有相同字母的原種間差異不顯著(如a與a，a與ab，b與ab)；不同字母原種間差異顯著(a與b)．圖2 母蛾帶毒<1時的子代帶毒分析

字母a，b代表差異原種，含有相同字母的原種間差異不顯著(如a與a，a與ab，b與ab)；不同字母原種間差異顯著(a與b)．圖3 母蛾帶毒1～10時的子代帶毒分析

2.5 母蛾帶毒>100時對子代感染率和感染強度的影響

在母蛾帶毒>100時，子代感染率由低到高依次是云7、湘753、蘇菊、872、菁松B×A、芙蓉932、皓月B×A和871，而子代感染強度具有較為一致的趨勢(圖5)．高程度帶毒母蛾(>100)子代感染率均高于50%，感染強度均大于80，兩項數(shù)據(jù)皆高于低程度帶毒母蛾組；其中云7、蘇菊與芙蓉932、皓月B×A和871在子代感染率和子代感染強度上存在顯著性差異．相較于母蛾帶毒10～100時，871子代感染率和子代感染強度急劇上升且明顯高于其他組，為最易感品系，云7和蘇菊為相對抗性品系，表明不同原種間對微粒子的抗性確實存在差異．

字母a，b代表差異原種，含有相同字母的原種間差異不顯著(如a與a，a與ab，b與ab)；不同字母原種間差異顯著(a與b)．圖4 母蛾帶毒10～100時的子代帶毒分析

字母a，b代表差異原種，含有相同字母的原種間差異不顯著(如a與a，a與ab，b與ab)；不同字母原種間差異顯著(a與b)．圖5 母蛾帶毒>100時的子代帶毒分析

3 討 論

家蠶微粒子病對蠶業(yè)生產具有毀滅性危害，是檢疫蠶種質量的唯一指標[14]．當前，家蠶微粒子病在蠶種生產上有抬頭的趨勢[15]，該疫病一方面通過食下水平傳播，另一方面利用胚傳垂直傳播．在防控家蠶微粒子方面，首先應做到嚴防胚種傳染，其次對卵、蠶、繭、蛹、蛾進行篩選，最后要做好消毒防病工作[16]．在胚種傳染中，母蛾的帶毒程度是次代蠶遺傳毒率的重要影響因素[17]，因此掌握母蛾感染程度與胚傳帶毒之間的規(guī)律，了解原種間的抗性差異對防控家蠶微粒子具有重要的意義[18]．

微粒子檢疫方法眾多，為生產無毒蠶種，杜絕胚種傳染，生產上常用母蛾鏡檢法，通過淘汰帶毒母蛾杜絕帶毒卵的產生達到目的．因單蛾檢驗的工作量大、時間性強，且需要耗費大量的人力、物力，在省時效率上不可避免地存在缺點．目前以顯微鏡能否看到微粒子來判斷母蛾是否帶毒，而能否觀察到微粒子，則受觀察人員技術水平及經驗等諸多因素的影響．在此情況下，逐漸發(fā)展出母蛾集團檢驗，根據(jù)統(tǒng)計概率學原理計算母蛾感染率．1979年在日本編著的《微粒子病檢查指南》中規(guī)定，允許病蛾率為0.5%．在現(xiàn)有母蛾檢測的抽樣方案和判別標準下，因家蠶微粒子病實際流行程度(母蛾感染率或感染程度)的不同，所以同一判斷標準(允許病蛾率0.5%，30%的平均胚傳率)對檢測結果也有不同的影響[8]．由8個家蠶原種感染微粒子胚傳子代平均趨勢分析可知，4種不同程度的帶毒母蛾子代感染率均值約為35%(圖1)，高于現(xiàn)行30%的平均胚傳率，所以需要制定更加合理的成品卵檢疫標準．目前生產實踐中母蛾檢驗大多只統(tǒng)計感染率，但在一定程度上感染率只是一個定性標準，其受到樣本與本體不一致、自身的可變性、顯微鏡檢驗技術和帶毒雄蛾等諸多因素的影響[19]．在王裕興等[20]對家蠶成品卵檢疫技術的可靠性分析研究中，發(fā)現(xiàn)成品卵毒率、微粒子病遺傳毒率、當代母蛾毒率以及蠶繭質量間存在明顯的相關性，且成品卵檢疫可基本排除人為因素對蠶種檢疫結果錯判的影響，比母蛾檢疫更具有質量保證．在本研究中母蛾帶毒1～10時，871和芙蓉932的子代感染率均為22.22%，但871的子代感染強度卻低于芙蓉932．因此與先前研究不同，本文在母蛾檢驗時將孢子密度(子代感染強度)也作為蠶種質量判斷因素之一．目前，微粒子檢疫在分子生物學方面展現(xiàn)出巨大潛力，利用PCR反應設計家蠶微粒子特異引物以達到檢測微粒子的目的，且逐漸向快速、靈敏、低成本靠攏[21-22]．在免疫學方面，利用抗原抗體特異性結合的原理，研制家蠶微粒子單克隆抗體，設計出對微粒子高靈敏的檢測試紙[23]．在藥物治療方面，除了防微靈等傳統(tǒng)的農藥，目前也向高效、廣譜及安全等方面發(fā)展[24]．

在本研究中母蛾帶毒程度為<1和1～10時，云7的子代帶毒率和子代感染強度均最低，表現(xiàn)出相對明顯的抗性．當母蛾帶毒程度增大為10～100時，云7對微粒子的抗性則有所減弱．這表明當前研究中的8個實用品系，沒有一個品系在任何帶毒程度下可以達到對微粒子的最大抗性，即母蛾帶毒情況不同時，有不同的原種相對抗性較強．這與王裕興等[20]研究結果一致：不同家蠶原種、不同母蛾帶毒情況均會對胚傳產生影響．母蛾帶毒程度是影響胚傳最為關鍵的因素，且在不同帶毒情況下母蛾帶毒與子代帶毒呈正相關[25]．總體而言，本研究8個實用品系中871抗性相對較弱，若針對性防控微粒子應盡量選用云7、蘇菊等抗性較強的品系．通過把現(xiàn)有實用品系中抗性較強的原種當作育種素材，培育抗性品系還任重道遠．值得思考的是，不同的家蠶原種與母蛾感染程度對胚傳造成的影響是否存在一定的關系？即低胚傳的原種是否也具有高抗性，兩者之間是否有必然聯(lián)系？相關問題還需要進一步深入研究．