奇崗微繁技術(shù)建立及幼苗耐鹽性評(píng)價(jià)

王曄，陳慧萍，李潤(rùn)枝，彭真，范希峰，武菊英*，段留生，2*

（1.北京農(nóng)學(xué)院，植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑教育部工程研究中心，北京100193；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京100097）

奇崗（Miscanthus×giganteus）是禾本科芒屬（Miscanthus）多年生草本植物，來(lái)源為二倍體芒（Miscanthus sinensis）和四倍體荻（Miscanthussacchariflorus）自然雜交形成的三倍體雜交種［1］，原產(chǎn)于日本，在歐洲作為主要能源植物廣泛種植，后來(lái)也作為園林觀賞植物，逐漸散布于各地。奇崗因具有光合效率強(qiáng)、水分養(yǎng)分利用效率高［2］；生物產(chǎn)量高、纖維品質(zhì)好、灰分含量低［1-2］；抗旱耐寒、入侵性低、邊際土地生長(zhǎng)能力強(qiáng)［3］等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注，除了可以觀賞，也可以用于飼料、制造優(yōu)質(zhì)紙漿、建筑材料和發(fā)電等［2］，是一種具有巨大潛在利用價(jià)值的節(jié)水型觀賞植物和能源植物。

奇崗作為異源三倍體，結(jié)實(shí)率很低，難以利用種子繁殖，主要通過(guò)根狀莖繁殖［4］，但繁殖速度很慢，種植成本較高且不利于運(yùn)輸和保存，嚴(yán)重影響了其推廣和研究［5］。利用組織培養(yǎng)技術(shù)不僅繁殖系數(shù)高、周期短、可產(chǎn)生大量植株，是一種方便、快捷、有效的繁殖手段，也是近期國(guó)內(nèi)外研究芒屬植物繁殖的熱點(diǎn)方向［6］。目前國(guó)外已有奇崗微繁的相關(guān)報(bào)道，主要集中在外植體選擇［7-8］、不同培養(yǎng)基的組合［9］、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的影響［10］及微生物接種促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)能力［2］等方面，但尚未建立規(guī)?；瘧?yīng)用的奇崗微繁技術(shù)體系，繁殖效率仍然較低，成本較高，尚難以滿足大面積種植需要［11］。

我國(guó)目前對(duì)奇崗的微繁技術(shù)研究較少，同時(shí)我國(guó)大量邊際性土地和園林綠化用地存在鹽堿或鹽漬化的問(wèn)題，奇崗幼苗能否在高鹽土壤上生長(zhǎng)還缺乏研究。本研究在國(guó)外研究成果基礎(chǔ)上，從腋芽生枝途徑建立奇崗微繁技術(shù)，評(píng)價(jià)試管苗生長(zhǎng)對(duì)鹽脅迫的耐性，以期建立簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、繁殖系數(shù)高的奇崗無(wú)性繁殖體系，為利用稀缺材料高效培育高質(zhì)量種苗，加快奇崗?fù)茝V應(yīng)用和在鹽漬化土地利用提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

奇崗（M.×giganteus）于2004年種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)校內(nèi)試驗(yàn)地（40°01′N(xiāo)，116°36′E）和北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心試驗(yàn)基地（39°34′N(xiāo)，116°28′E）。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中添加5.0 mg·L-16-芐氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）、0.25 mg·L-1萘乙酸（1-naphthalene acetic acid，NAA）、750.0 mg·L-1MgCl2·6H2O、20.0 g·L-1蔗糖和3.0 g·L-1Gelrite，pH為5.5～5.8。培養(yǎng)溫度為（26±1）℃，光照/黑暗16 h/8 h，光照強(qiáng)度35μmol·m-2·s-1。

1.3 外植體消毒和選材

1.3.1 外植體消毒 選取處于旺盛生長(zhǎng)階段的奇崗莖稈，去除葉片，截取莖節(jié)上下1.5 cm莖段，在超凈工作臺(tái)上采用下列4種方法消毒，D1：用0.1%氯化汞（HgCl2）浸泡20 min；D2：1.5%HgCl2浸泡5 min；D3：1.0%次氯酸鈉（NaClO）浸泡20 min；D4：用75%酒精噴灑表面后，再用1.0%NaClO浸泡20 min。選取所有的方法消毒完畢后，均用無(wú)菌水沖洗3次以上，用無(wú)菌濾紙吸去水分后接種。每個(gè)處理10瓶，每瓶接種5個(gè)莖段外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)10 d后統(tǒng)計(jì)污染率（污染率=污染個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù)×100%）和出芽率（出芽率=未污染出芽個(gè)數(shù)/未污染接種個(gè)數(shù)×100%）。

1.3.2 外植體選材 選取完全展開(kāi)葉片數(shù)為5～6片、8～9片和10片時(shí)的健壯生長(zhǎng)的植株，去除葉片，保留葉鞘，取莖節(jié)上下1.5 cm莖段，根據(jù)1.3.1試驗(yàn)結(jié)果，選擇消毒方法。每個(gè)處理10瓶，每瓶接種5個(gè)莖段外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)10 d后統(tǒng)計(jì)出芽率和增殖倍數(shù)（增殖倍數(shù)=增殖后的莖段數(shù)/接種的莖段數(shù)）。

1.4 誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基的篩選

選取完全展開(kāi)葉片數(shù)為5～6片的植株，將無(wú)菌莖段分別接種到加入含不同濃度6-BA的培養(yǎng)基中：1）1.0 mg·L-16-BA；2）3.0 mg·L-16-BA；3）5.0 mg·L-16-BA；4）7.0 mg·L-16-BA。每個(gè)處理10瓶，每瓶接種5個(gè)莖段外植體，重復(fù)3次。每隔30 d繼代一次，統(tǒng)計(jì)繁殖系數(shù)（繁殖系數(shù)=繼代后獲得的莖段數(shù)/原有莖段數(shù)×100%）。

1.5 生根培養(yǎng)

選擇繼代培養(yǎng)獲得的生長(zhǎng)健壯的叢生莖接種到加入5.0 g·L-1活性炭的1/2 MS培養(yǎng)基中，以不添加活性炭為對(duì)照，每個(gè)處理10瓶，每瓶接5叢，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)根數(shù)、根長(zhǎng)和發(fā)根植株的株高等。

1.6 耐鹽適應(yīng)性

采用水培試驗(yàn)，在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)光照培養(yǎng)室中進(jìn)行，光照強(qiáng)度為600μmol·cm-2·s-1，光照/黑暗時(shí)間為16 h/8 h，晝/夜溫度為（25±2）°C/（15±2）°C，相對(duì)濕度為60%～70%。選取生長(zhǎng)健壯的試管苗移栽到1/2 Hongland培養(yǎng)液中，培養(yǎng)7 d后，在全營(yíng)養(yǎng)液中再培養(yǎng)7 d后進(jìn)行鹽脅迫處理。加入NaCl濃度分別為0、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%。每處理移栽10株，重復(fù)3次。每隔4 d更換一次培養(yǎng)液，保持24 h通氣。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件的ANOVA法進(jìn)行差異顯著性分析，用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖段外植體消毒方法篩選

不同消毒方法對(duì)莖段外植體腋芽發(fā)生誘導(dǎo)率和污染率影響較大（表1），其中，1.0%NaClO浸泡20 min處理的誘導(dǎo)率較高（72.5%），但其污染率（12.5%）顯著高于其他處理（P＜0.05）；1.5%NaClO浸泡20 min處理消毒效果雖好，但對(duì)植株組織傷害較大，降低了誘導(dǎo)率（23.3%）。對(duì)植株組織先用70%酒精噴灑表面，再用1.0%NaClO溶液浸泡20 min消毒效果最佳，沒(méi)有污染，且誘導(dǎo)率高達(dá)85.2%。

表1 莖段外植體消毒方法篩選Table 1 Screening of sterilization methods for explants of nodal segments（%）

2.2 莖段外植體生長(zhǎng)時(shí)期的選擇

由表2可以看出，在相同培養(yǎng)條件下，外植體的取材時(shí)期不同，出芽誘導(dǎo)率也受到影響。不同取材時(shí)期的可用外植體數(shù)差異不顯著。隨著葉齡的增加，出芽率降低，增殖倍數(shù)也呈降低趨勢(shì)。當(dāng)在5～6葉取材時(shí)，外植體出芽率最高為83.95%，增殖倍數(shù)為3.98。因此，綜合比較，5～6葉時(shí)期取材（圖1A），增殖效率最高，8～9葉期和10葉以上取材繁殖效率較低。

圖1 奇崗微繁植株再生體系Fig.1 Plant regeneration system of M.×giganteus

表2 不同取材時(shí)期對(duì)增殖倍數(shù)的影響Table 2 Effects of nodal segments developmental stage on bud induction rate and proliferation multiples

2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

由表3可見(jiàn)，莖段接入添加6-BA的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，在30 d時(shí)統(tǒng)計(jì)腋芽發(fā)生（圖1B），不同濃度6-BA對(duì)奇崗出芽誘導(dǎo)率沒(méi)有顯著影響（82.75%～84.09%）。隨著繼代培養(yǎng)基中添加6-BA濃度增加，繁殖系數(shù)呈先增高后降低趨勢(shì)。當(dāng)6-BA濃度較低，為1.0 mg·L-1時(shí)，繁殖系數(shù)最低，但出芽誘導(dǎo)率高；當(dāng)6-BA濃度為5.0 mg·L-1時(shí)，繁殖系數(shù)較其他濃度6-BA處理顯著增加；6-BA濃度為3.0和7.0 mg·L-1時(shí)繁殖系數(shù)差異不顯著。相同濃度6-BA處理，對(duì)一代（30 d）、二代（60 d）和三代（90 d）間繁殖系數(shù)影響不顯著。由此可見(jiàn)，6-BA濃度5.0 mg·L-1為適宜濃度，每繼代一次，一個(gè)莖段平均可增加2～3個(gè)幼芽，繁殖系數(shù)平均可達(dá)341.67%。

表3 不同濃度6-BA處理對(duì)莖段外植體出芽率和繁殖系數(shù)的影響Table 3 Effects of different 6-BA levels on bud induction rate and multiplication coefficient of nodal segments explants

2.4 生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)后的奇崗叢生芽（圖1C）轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)基中加入活性炭，生根率、幼苗株高和根數(shù)與對(duì)照相比無(wú)顯著差異（表4）。平均根長(zhǎng)與對(duì)照相比，提高了1.5倍，且達(dá)顯著水平，而且根的質(zhì)量提高，變得柔軟不易折斷，移栽時(shí)成活率提高了1.1倍，減少了移栽失敗造成的人力物力浪費(fèi)從而提高了經(jīng)濟(jì)效益。

表4 活性炭對(duì)奇崗生根壯苗的影響Table 4 Effects of activated carbon on the rooting and transplantation of M.×giganteus

2.5 不同NaCl濃度對(duì)微繁苗生長(zhǎng)速率和生物量的影響

試管苗經(jīng)煉苗移栽至不同NaCl濃度的水培營(yíng)養(yǎng)液中，隨著培養(yǎng)液中NaCl的濃度增加，微繁苗生長(zhǎng)速率呈降低趨勢(shì)（表5）。脅迫處理7 d，NaCl濃度大于0.2%，植株生長(zhǎng)速率顯著減慢，但仍能存活。脅迫處理14 d后，0.8%濃度的NaCl處理植株逐漸枯萎死亡；0.4%和0.6%濃度的NaCl處理使植株生長(zhǎng)速度緩慢，根開(kāi)始變軟，變褐，均表現(xiàn)出鹽害現(xiàn)象，但是兩者的生長(zhǎng)速率差異不顯著；當(dāng)NaCl濃度為0.2%時(shí)，與對(duì)照相比，植株根系發(fā)生量多，根系較硬，較長(zhǎng)，也有小的腋芽發(fā)生，且生長(zhǎng)速率和生物量與對(duì)照相比差異不顯著。

表5 不同NaCl濃度對(duì)奇崗微繁苗生長(zhǎng)速率和生物量的影響Table 5 Effects of differ ent NaCl concentrations on the gr owth r ate and fr esh weight of M.×giganteus

3 討論與結(jié)論

3.1 外植體及消毒方法對(duì)奇崗微繁效果的影響

外植體的生理狀態(tài)、生長(zhǎng)周期、可用數(shù)目、誘導(dǎo)率都是影響繁殖效率的重要因素。奇崗組織培養(yǎng)在腋芽發(fā)生途徑的微繁中常以莖節(jié)［12］和莖尖［13］為外植體。由于莖尖器官幼嫩對(duì)取材和消毒處理要求較高，且一個(gè)植株只能獲得一個(gè)莖尖，繁殖系數(shù)低。以莖段為外植體時(shí)，操作簡(jiǎn)便易行，但不同生長(zhǎng)期的莖段對(duì)微繁效果和幼苗質(zhì)量有一定影響。本研究用不同葉齡的莖段微繁發(fā)現(xiàn)，5～6葉齡奇崗植株的莖段做外植體出芽率和增殖系數(shù)均最高；5葉齡前的莖段物質(zhì)積累較少，微繁成苗率低、幼苗長(zhǎng)勢(shì)弱；8葉齡后奇崗下部莖節(jié)木質(zhì)化程度逐漸增加，再取莖段培養(yǎng)誘導(dǎo)率低，消毒處理比較困難。

不同消毒劑濃度和處理時(shí)間對(duì)奇崗微繁過(guò)程中污染率和誘導(dǎo)率影響較大。Nielsen等［12］采用1.5%NaClO浸泡20 min消毒莖段，誘導(dǎo)率較低；Lewandowski［13］先用70%酒精浸泡3 s，再用1.5%NaClO浸泡5 min對(duì)外植體消毒，莖段污染率高，且褐化嚴(yán)重。本研究對(duì)莖段外植體用75%酒精噴灑表面后再用1.0%NaClO浸泡20 min，獲得了較好的滅菌效果，同時(shí)保證了較高的誘導(dǎo)率。

3.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和活性炭對(duì)奇崗微繁效果的影響

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是微繁培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，其種類(lèi)、用量和組合對(duì)培養(yǎng)物的誘導(dǎo)分化起重要作用［14-16］。本研究結(jié)果表明，6-BA濃度為5.0 mg·L-1時(shí)，莖段增殖率最高，為362.58%，當(dāng)6-BA濃度達(dá)7.0 mg·L-1時(shí)，莖段開(kāi)始出現(xiàn)玻璃化，可見(jiàn)，6-BA的誘導(dǎo)作用顯著，不僅能促進(jìn)細(xì)胞分裂膨大，也利于莖生長(zhǎng)、側(cè)芽發(fā)生及增殖，但高濃度則有抑制作用［17-18］。綜合誘導(dǎo)率和繁殖系數(shù)，在腋芽生枝途徑微繁體系培養(yǎng)基中6-BA適宜濃度范圍為3.0～5.0 mg·L-1，但各濃度下均未產(chǎn)生根系。

活性炭具有極高的吸附能力被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)中，本試驗(yàn)添加5.0 g·L-1活性炭顯著提高了根系質(zhì)量，有利于培養(yǎng)壯苗。莫遠(yuǎn)琪等［19］研究發(fā)現(xiàn)活性炭濃度在1.0～2.0 g·L-1對(duì)澳洲鴿子石斛（Dendrobium kingianum）的株高和葉片數(shù)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但根數(shù)和根長(zhǎng)變化不大。馬麗娜等［17］研究新塔花（Ziziphora bungeana）組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)添加0.1%～0.2%活性炭與生長(zhǎng)素配比使用達(dá)到壯苗效果，生根植株長(zhǎng)勢(shì)較好，推測(cè)一定濃度的活性炭吸附了植株生根培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的酚類(lèi)物質(zhì)，說(shuō)明活性炭在植物生根培養(yǎng)過(guò)程中起著重要作用。同時(shí)還能將培養(yǎng)基變黑提供類(lèi)似土壤的暗化條件，有利于離體生根和根生長(zhǎng)［20］。

3.3 奇崗微繁移栽苗的耐鹽性評(píng)價(jià)

鹽脅迫會(huì)使植株正常生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重限制，成活率降低且株體生長(zhǎng)量銳減［21］。林聰［21］對(duì)芒屬植物進(jìn)行田間鹽脅迫研究中發(fā)現(xiàn)南荻（Miscanthuslutarioriparia）在輕度（平均含鹽量0.4%）和中度（平均含鹽量0.5%）鹽堿地上耐鹽能力均較強(qiáng)，而對(duì)奇崗的耐鹽能力沒(méi)有涉及。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)奇崗微繁試管苗進(jìn)行NaCl脅迫處理14 d，0.8%NaCl濃度下微繁苗逐漸枯萎死亡；低于0.8%的NaCl脅迫處理，植株生長(zhǎng)速率雖受到抑制，但仍然存活，與段鈞譯等［22］對(duì)奇崗幼苗NaCl脅迫下的表現(xiàn)一致。說(shuō)明在較高鹽濃度條件下奇崗微繁苗能夠正常生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的耐鹽性。