貯藏年限對(duì)裸燕麥種帶真菌和真菌毒素的影響

聶秀美，慕平，趙桂琴，何海鵬，吳文斌，藺豆豆，蘇偉娟，張麗睿

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州730070）

裸燕麥（Avena nuda）是禾本科燕麥屬一年生糧飼兼用作物，廣泛種植于我國(guó)華北和西北等半干旱地區(qū)，每年種植面積約60萬(wàn)hm2［1-2］。研究表明，裸燕麥籽粒含有大量易消化和高熱量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如粗蛋白（12%～18%）、粗脂肪（4%～6%）、礦物質(zhì)和可溶性膳食纖維（11%～18%）等，能夠促進(jìn)人體和畜禽腸道系統(tǒng)中有益菌的繁殖，調(diào)節(jié)血脂和血糖，改善血液循環(huán)等［3-4］。此外，燕麥籽粒因其粗蛋白、粗脂肪和可溶性糖含量高，難以消化的粗纖維含量低，是牛、馬等家畜補(bǔ)飼肥膘的優(yōu)質(zhì)飼料［5］。

隨著人們對(duì)裸燕麥種子保健功能認(rèn)識(shí)的逐步提高，以及國(guó)家“糧改飼”“引草入田”和“草牧業(yè)”等重大政策的推行實(shí)施，燕麥種植面積和種子需求量不斷增加。種子在生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中不可避免地會(huì)攜帶大量的真菌，這些真菌可通過(guò)自身的分解作用對(duì)種子中的有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行消化、吸收和利用，導(dǎo)致種子劣變、縮短種子貯藏年限、增加病原菌傳播風(fēng)險(xiǎn)，甚至影響種子安全貯藏和幼苗健康［6-7］。此外，種子在貯藏過(guò)程中，大多數(shù)霉菌在適宜的生境下會(huì)代謝產(chǎn)生真菌毒素，長(zhǎng)期攝入低含量毒素會(huì)引起代謝紊亂、免疫力下降以及皮膚、肝臟和胃腸道等的病變；短期內(nèi)攝入毒素含量過(guò)高，可引起生殖毒性、細(xì)胞毒性、癌變和畸變等，對(duì)人畜健康具有極大威脅［8-9］。

據(jù)聯(lián)合國(guó)統(tǒng)計(jì)，全世界每年被真菌毒素污染的谷物占25%左右，即使某些種子外表未發(fā)現(xiàn)霉變，卻已被霉菌毒素侵染［10］。因此，種子帶菌是危害人畜健康和安全的一大因素，對(duì)種子攜帶的真菌和真菌毒素進(jìn)行早期檢測(cè)至關(guān)重要。但截至目前，國(guó)內(nèi)對(duì)裸燕麥種子的帶菌檢測(cè)僅見荊卓瓊等［11］通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，從2個(gè)裸燕麥品種中分離鑒定出11個(gè)屬的真菌；馬從［12］對(duì)甘肅省的2個(gè)裸燕麥品種通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察檢出6屬14種真菌；聶秀美等［13］通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，從不同產(chǎn)地的4份裸燕麥材料中分離出真菌13屬30種。而有關(guān)貯藏年限對(duì)裸燕麥種子在貯藏過(guò)程中受真菌污染、帶菌及產(chǎn)毒情況等方面的研究還尚未見報(bào)道。因此，本研究擬以3個(gè)主栽品種為研究對(duì)象，對(duì)其在貯藏期間所攜帶的真菌和其產(chǎn)生的毒性較強(qiáng)的真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)，以明確貯藏年限對(duì)裸燕麥種子帶菌情況和真菌毒素含量的影響，為裸燕麥種子的安全貯藏和生產(chǎn)利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試裸燕麥品種為白燕2號(hào)、壩莜9號(hào)和壩莜14號(hào)，于2017、2016、2015和2013年在甘肅省定西市通渭縣華家?guī)X鎮(zhèn)收獲，收獲的種子貯藏于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草實(shí)訓(xùn)基地種子室，種子貯藏期間的月均溫和月均相對(duì)濕度（用HC-520溫濕度測(cè)量?jī)x記錄）（圖1）。試驗(yàn)于2018年6月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，供試材料分別貯藏了1、2、3和5年。

圖1 種子貯藏期間的月均溫和月均相對(duì)濕度Fig.1 Monthly average temperature and relative humidity during seed storage

1.2 種子帶菌檢測(cè)

1.2.1 種子外部帶菌檢測(cè) 參照耿麗華等［7］和高葦?shù)龋?4］的方法稍做改動(dòng)后進(jìn)行種子帶菌檢測(cè)。每個(gè)品種隨機(jī)取200粒完整種子分別放入50 mL滅菌三角瓶，加無(wú)菌水20 mL后于180 r·min-1的搖床上充分振蕩1 h。在無(wú)菌條件下吸取1 mL菌懸液均勻涂布到直徑90 mm的PDA（potato dextrose agar，馬鈴薯葡萄糖瓊脂）平板上（內(nèi)加硫酸鏈霉素和卡那霉素各100 mg·L-1），每處理3個(gè)重復(fù)，涂布好的平板置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。從第3天起進(jìn)行觀察，及時(shí)挑取菌落至新鮮PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行分離，對(duì)分離出的真菌進(jìn)行純化和保存。待不再有新的菌落出現(xiàn)時(shí)，按稀釋倍數(shù)和檢測(cè)種子數(shù)計(jì)算孢子負(fù)荷量和檢出真菌的分離率。

1.2.2 種子內(nèi)部帶菌檢測(cè) 每個(gè)品種隨機(jī)選取200粒完整種子，于超凈工作臺(tái)經(jīng)75%酒精浸泡2 min，1%次氯酸鈉消毒5 min，無(wú)菌水漂洗4次，滅菌濾紙吸干種子表面的水分后，均勻擺放在90 mm的PDA培養(yǎng)基上（內(nèi)加硫酸鏈霉素和卡那霉素各100 mg·L-1），每皿10粒，5皿為一重復(fù)，4次重復(fù)。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。從第3天起進(jìn)行觀察，及時(shí)挑取菌落至新鮮PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行分離、純化和保存。待不再有新的菌落出現(xiàn)時(shí)，統(tǒng)計(jì)帶菌種子數(shù)和帶某種真菌的種子數(shù)，并計(jì)算種子帶菌率和某菌分離率。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將分離純化出的真菌在25℃黑暗培養(yǎng)箱再次純化培養(yǎng)7 d后，參考《植物病原真菌學(xué)》［15］和《真菌分類學(xué)》［16］，用Revolve RVL-100-G顯微鏡觀察菌落和分生孢子的顏色、形狀和大小等形態(tài)學(xué)特征，進(jìn)行初步鑒定。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

采用Omega真菌基因組試劑盒提取菌株DNA。

利用真菌通用引物對(duì)ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。其中PCR反應(yīng)體系為50μL：2×Taq PCR Master Mix 25μL，模板5μL，正反向引物各1μL，補(bǔ)充ddH2O至50μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72℃下延伸7 min。反應(yīng)完成后，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)和紫外凝膠成像儀觀察，然后送樣進(jìn)行測(cè)序及比對(duì)分析后，用Mega 7.0軟件中的鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 真菌毒素含量的檢測(cè)

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 細(xì)交鏈孢酮酸（tenuazonic acid，TeA）、黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）和桔青霉素（citrinin，CIT）3種真菌毒素（規(guī)格均為1 mg，純度＞99%）均用純甲醇溶解，配制成濃度均為100μg·mL-1的母液。吸取TeA、AFB1和CIT母液各500μL，配成濃度為500 ng·mL-1的TeA標(biāo)準(zhǔn)溶液、AFB1和CIT混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用甲醇依次稀釋成濃度為100、50、20、8和0.4 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，存貯于-20℃冰箱中備用。

1.5.2 樣品處理 參照王芹等［17］和任貝貝［18］的方法，做適當(dāng)改進(jìn)后進(jìn)行樣品中毒素含量的檢測(cè)。每份種子樣品稱取20.00 g（精確到0.01 g），經(jīng)小型谷物粉碎機(jī)粉碎后各取5.00 g（精確到0.01g）于50 mL離心管，重復(fù)3次。各樣品加入30 mL乙腈-水溶液（84∶16，V∶V）經(jīng)QL-866渦旋振蕩儀渦旋混勻后于室溫下浸泡1 h，30℃恒溫超聲30 min，10000 r·min-1離心10 min，取上清液25 mL于-20℃冰箱靜置3 h后，重新吸取上清液20 mL在50℃下經(jīng)Christ RVC 2-33 IR真空離心濃縮儀濃縮至近干，殘?jiān)尤胍译?水（40∶60，V∶V）混合溶液1 mL，經(jīng)渦旋振蕩儀混勻溶解后超聲5 min，經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后用Agilent 1100高效液相色譜質(zhì)譜儀（high performance liquid chromatography mass spectrometry，HPLC-MS）檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接、校對(duì)，在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST序列同源性比對(duì)分析，用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏年限對(duì)裸燕麥種子帶菌量的影響

由表1可知，隨貯藏年限的變化，各供試種子外部的孢子負(fù)荷量差異較大，為0.60～8.40 cfu。其中白燕2號(hào)在貯藏5年時(shí)的孢子負(fù)荷量（1.57 cfu）最高，貯藏3年時(shí)僅有0.60 cfu，顯著低于其他年限（P＜0.05）。壩莜9號(hào)貯藏3年時(shí)的負(fù)荷量最高（4.17 cfu，P＜0.05），貯藏2年時(shí)的負(fù)荷量最低（1.73 cfu），較前者降低了58.51%。壩莜14號(hào)貯藏1年時(shí)的孢子負(fù)荷量為8.40 cfu，顯著高于其他年限（P＜0.05），且高于其他參試材料。

表1 不同貯藏年限裸燕麥種子的帶菌量Table 1 The amount of fungi in naked oat seeds with different stor age year s

各參試材料在不同貯藏年限的內(nèi)部帶菌率存在明顯差異，隨貯藏年限的增加總體表現(xiàn)為下降趨勢(shì)。帶菌率變幅為2.75%～28.50%，其中白燕2號(hào)在貯藏1年時(shí)帶菌率最高，為6.00%（P＜0.05）。貯藏2年時(shí)壩莜9號(hào)帶菌率為28.50%，較貯藏1、3和5年分別增加了42.11%、70.18%和84.21%（P＜0.05），且高于其他材料。壩莜14號(hào)在貯藏1年時(shí)帶菌率最高，為20.25%，隨后顯著下降，貯藏5年時(shí)帶菌率最低（2.75%），較貯藏1年時(shí)降低了86.42%。

2.2 裸燕麥種帶真菌的鑒定

部分分離真菌的菌落、孢子形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果如下：

AS2在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，直徑約62 mm，菌落隆起，呈粗絨狀，正面中央褐色至灰褐色，邊緣呈白色，背面黑褐色，邊緣褐色，具同心輪紋。分生孢子單生或串生，倒棍棒狀、倒梨形或橢圓形，淡黃褐色至褐色，具橫隔1～6個(gè)，縱隔0～3個(gè)，部分含有短喙，大小為（9.1～24.2）μm×（3.4～8.5）μm，根據(jù)形態(tài)特征可初步鑒定為細(xì)交鏈孢（Alternaria alternate，圖2）。進(jìn)一步通過(guò)序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，AS2與A.alternate（MK656442）聚在同一分支，說(shuō)明二者親緣關(guān)系很近，由此鑒定為A.alternate。

圖2 細(xì)交鏈孢的形態(tài)特征及系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Morphological characteristics and phylogenetic tree of A.alternate

AS6在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，3～4 d即可長(zhǎng)滿整個(gè)平板，菌落呈絨毛狀或棉絮狀，正面初期白色，后中央為白色，邊緣呈淡黃色，背面呈黃褐色，具同心環(huán)。分生孢子單生，呈球形或近球形，褐色至深褐色，無(wú)隔膜，大小（11.6～14.6）μm×（10.6～13.8）μm，根據(jù)形態(tài)特征可初步鑒定為節(jié)菱孢菌（Arthrinium rasikravindrae，圖3）。進(jìn)一步通過(guò)序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，AS6與A.rasikravindrae（MF326617）聚在同一分支，說(shuō)明二者親緣關(guān)系很近，由此鑒定為A.rasikravindrae。

圖3 節(jié)菱孢菌的形態(tài)特征及系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Morphological characteristics and phylogenetic tree of A.rasikravindrae

AS9在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，直徑約84 mm，菌落平坦干燥，呈粗粉狀，正面黃綠色，背面呈焦黃色。分生孢子單生，呈球形，黃綠色，無(wú)隔膜，大小為2.3～5.0μm，根據(jù)形態(tài)特征可初步鑒定為黃曲霉（Aspergillus flavus，圖4）。進(jìn)一步通過(guò)序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，AS9與A.flavus（MN095161）聚在同一分支，說(shuō)明二者親緣關(guān)系很近，由此鑒定為A.flavus。

圖4 黃曲霉的形態(tài)特征及系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Morphological char acter istics and phylogenetic tr ee of A.flavus

AS17在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，直徑約15 mm，菌落稍隆起，中央有裂紋，呈粉狀，正面橄欖綠色，背面橄欖褐色。分生孢子單生，近球形或卵形，大小為（3.2～6.7）μm×（1.8～2.9）μm，根據(jù)形態(tài)特征可初步鑒定為枝細(xì)枝孢（Cladosporium ramotenellum，圖5）。進(jìn)一步通過(guò)序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，AS17與C.ramotenellum（MG548565）和C.ramotenellum（MH 383201）聚在同一分支，說(shuō)明三者親緣關(guān)系很近，由此鑒定為C.ramotenellum。

圖5 枝細(xì)枝孢的形態(tài)特征及系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Morphological char acter istics and phylogenetic tr ee of C.ramotenellum

AS29在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，直徑約21 mm，菌落呈粉狀兼絨狀，正面初期藍(lán)綠色，具臍狀突起，背面中央淡紅褐色，邊緣奶黃色。分生孢子單生，呈球形，藍(lán)綠色，無(wú)隔膜，大小1.9～3.4μm，根據(jù)形態(tài)特征可初步鑒定為鮮綠青霉（Penicillium verrucosum，圖6）。進(jìn)一步通過(guò)序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，AS29與P.verrucosum（MH 860078）聚在同一分支，說(shuō)明二者親緣關(guān)系很近，由此鑒定為P.verrucosum（圖6）。

圖6 鮮綠青霉的形態(tài)特征及系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Morphological characteristics and phylogenetic tree of P.verrucosum

AS32在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，2～3 d即可長(zhǎng)滿整個(gè)平板，菌落呈絲狀，正面初期乳白色，后期灰褐色。分生孢子單生，呈近球形或卵圓形，淡褐色，無(wú)隔膜，大小為（4.6～12.5）μm×（3.9～11.3）μm，根據(jù)形態(tài)特征可初步鑒定為米根霉（Rhizopus oryzae，圖7）。進(jìn)一步通過(guò)序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，AS32與R.oryzae（NR103595）聚在同一分支，說(shuō)明二者親緣關(guān)系很近，由此鑒定為R.oryzae。

圖7 米根霉的形態(tài)特征及系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Morphological characteristics and phylogenetic tree of R.oryzae

2.3 貯藏年限對(duì)裸燕麥種子帶菌種類和分離率的影響

2.3.1 貯藏年限對(duì)裸燕麥種子外部帶菌種類和分離率的影響 從各供試裸燕麥種子表面共檢出真菌14屬29種（表2），其中細(xì)交鏈孢在11份樣品中檢出，檢出率為91.67%；其次是黃曲霉，檢出率為66.67%。帶菌種類最多的是貯藏1和5年的壩莜14號(hào)，均攜帶11種真菌；貯藏1年的白燕2號(hào)和貯藏3年的壩莜9號(hào)中真菌種類檢出數(shù)最少，均僅有4種。

表2 裸燕麥種子表面的帶菌種類和分離率Table 2 Fungal species and isolation rates of naked oat seeds surface（%）

白燕2號(hào)在貯藏2、3和5年時(shí)均能檢出的真菌有細(xì)交鏈孢、塔賓曲霉（Aspergillustubingensis）和米根霉，而雅致放射毛霉（Actinomucor elegans，19.92%）、枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides，57.93%）和疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria，11.64%）僅存在于貯藏1年的種子中；煙曲霉（Aspergillus fumigatu，4.86%）和黑附球菌（Epicoccum nigrum，4.31%）僅在貯藏2年時(shí)發(fā)現(xiàn)；蕓薹鏈格孢（Alternaria brassicae，13.33%）和黑曲霉（Aspergillusniger，12.04%）僅存在于貯藏3年的種子中；節(jié)菱孢菌（1.85%）僅在貯藏5年時(shí)檢出。蔥鏈格孢（Alternaria porri）、黃曲霉和擬孢鐮孢菌（Fusarium sporotrichioid es）僅在貯藏2和3年時(shí)分離出，產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）存在于貯藏3和5年的種子中。

壩莜9號(hào)在所有貯藏年限中均能檢出的真菌僅有細(xì)交鏈孢，而蕓薹鏈格孢（2.98%）、藜生鏈格孢（Alternaria chenopodiicola，19.16%）、蔥鏈格孢（12.01%）和楸子莖點(diǎn)霉（Didymella pomorum，1.39%）僅在貯藏1年時(shí)檢出；寄生曲霉（Aspergillus parasiticus，3.44%）、枝細(xì)枝孢（3.70%）和產(chǎn)黃青霉（21.18%）僅在貯藏2年的種子中分離出；阿姆斯特丹曲霉（Aspergillus amstelodami，0.90%）和煙曲霉（4.51%）僅存在于貯藏3年的種子中；黑曲霉（2.08%）、擬孢鐮孢菌（6.61%）和米根霉（1.04%）僅在貯藏5年時(shí)檢出；塔賓曲霉僅在貯藏1和2年時(shí)檢測(cè)出，謝瓦氏曲霉（Aspergilluschevalieri）在貯藏3和5年時(shí)檢出。

細(xì)交鏈孢在壩莜14號(hào)所有貯藏年限的樣品中均能檢出，而擬孢鐮孢菌（1.20%）和鮮綠青霉（20.58%）僅在貯藏1年時(shí)分離出；塔賓曲霉（5.25%）、黑附球菌（2.22%）和德氏霉菌（Pyrenophora chaetomioides，32.76%）僅存在于貯藏2年的種子中；黑曲霉（7.41%）和裂褶菌（Schizophyllum commune，3.70%）在貯藏3年時(shí)分離出；紅曲霉（Aspergillusruber，4.32%）、肉桂紫青霉（Penicillium cinnamopurpureum，1.08%）和米根霉（2.82%）僅在貯藏5年的樣品中檢出。蔥鏈格孢和木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）在貯藏1和2年時(shí)都有檢出，藜生鏈格孢和產(chǎn)黃青霉僅存在于貯藏2和3年的種子中，謝瓦氏曲霉和煙曲霉僅在貯藏3和5年時(shí)檢出。

2.3.2 貯藏年限對(duì)裸燕麥種子內(nèi)部帶菌種類和分離率的影響 從不同貯藏年限的裸燕麥種子內(nèi)部共檢出12屬23種真菌（表3），其中最多的是細(xì)交鏈孢（100.00%），次高的是蕓薹鏈格孢和黃曲霉，均為66.67%。貯藏1年的壩莜14號(hào)所攜帶的真菌種類最多，為10種；貯藏5年的壩莜14號(hào)僅有4種。

表3 裸燕麥種子內(nèi)部的帶菌種類和分離率Table 3 Internal fungal species and isolation rates of naked oat seeds（%）

在不同貯藏年限的白燕2號(hào)種子內(nèi)部都分離出了細(xì)交鏈孢和黃曲霉。黑曲霉和塔賓曲霉在貯藏2～5年時(shí)均可檢出，且其分離率在第3年時(shí)最大；而藜生鏈格孢（11.70%）、蔥鏈格孢（6.70%）和擬枝孢鐮孢菌（8.57%）僅在貯藏1年時(shí)檢測(cè)出；蕓薹鏈格孢（5.00%）僅從貯藏3年的種子中分離出，玉米平臍蠕孢（Bipolaris zeae，8.33%）和黑附球菌（6.25%）僅在貯藏5年時(shí)發(fā)現(xiàn)。在貯藏1和2年的種子中均可檢出的僅有枝狀枝孢菌。產(chǎn)黃青霉僅從貯藏2和3年時(shí)的種子中檢出。

壩莜9號(hào)在貯藏1年時(shí)的優(yōu)勢(shì)菌為阿姆斯特丹曲霉（37.66%）；其他年限優(yōu)勢(shì)菌均為細(xì)交鏈孢，分離率為18.59%～57.14%。所有樣品中均可檢出的真菌有細(xì)交鏈孢和德氏霉菌。貯藏2～5年時(shí)可檢出的僅有蕓薹鏈格孢。僅從貯藏1年的種子中檢測(cè)到的是擬枝孢鐮孢菌（13.90%）、楸子莖點(diǎn)霉（11.27%）、稻黑孢菌（Nigrospora oryzae，1.56%）和裂褶菌（1.32%）。僅在貯藏2年時(shí)檢測(cè)出的是玉米平臍蠕孢（20.77%）。蔥鏈格孢（7.67%）、煙曲霉（14.77%）、枝細(xì)枝孢（13.92%）和短密青霉（Penicillium brevicompactum，2.27%）僅從貯藏3年的種子中分離出，黑曲霉（5.00%）和枝狀枝孢菌（8.33%）僅在貯藏5年時(shí)發(fā)現(xiàn)。木賊鐮刀菌僅在貯藏1和2年時(shí)檢測(cè)出，藜生鏈格孢和產(chǎn)黃青霉僅在貯藏3和5年檢出。

壩莜14號(hào)在貯藏5年時(shí)種子內(nèi)部分離率最高的是楸子莖點(diǎn)霉，為52.08%；其他年限分離率最高的均為細(xì)交鏈孢。不同貯藏年限共有的真菌有細(xì)交鏈孢、蕓薹鏈格孢和楸子莖點(diǎn)霉。貯藏1～3年的種子內(nèi)部可檢出的僅有木賊鐮刀菌和德氏霉菌，而擬枝孢鐮孢菌（1.19%）、絲枝蠟蚧菌（Lecanicillium aphanocladii，3.41%）和稻黑孢菌（3.57%）僅在貯藏1年時(shí)檢測(cè)出；蔥鏈格孢（21.67%）僅在貯藏2年時(shí)檢測(cè)出；阿姆斯特丹曲霉（9.82%）和黃曲霉（1.13%）僅在貯藏3年的種子中分離出；謝瓦氏曲霉（14.58%）僅在貯藏5年時(shí)發(fā)現(xiàn)。在貯藏1和2年時(shí)均可分離出枝細(xì)枝孢，而貯藏2和3年時(shí)均可檢出的僅有藜生鏈格孢。

2.4 裸燕麥種帶真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

通過(guò)對(duì)裸燕麥種子上分離獲得的不同菌株的基因組DNA進(jìn)行測(cè)序和同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)各被鑒定菌株與其對(duì)應(yīng)的比對(duì)菌株相似度均在97.00%以上。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提交被鑒定菌株AS1～AS33，獲得的菌株序列號(hào)為MT 503287～MT 503319。進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8），發(fā)現(xiàn)同一個(gè)屬的菌株基本都聚在一個(gè)較大的分支，不同屬的菌株單獨(dú)形成一支。共鑒定出17屬33種真菌，其中曲霉菌屬8種，青霉菌屬5種，鏈格孢屬4種，節(jié)凌孢屬（Arthrinium）1種、枝孢菌屬（Cladosporium）和鐮刀菌屬（Fusarium）各2種，德氏霉屬（Drechslera）、毛霉屬（Actinomucor）、蠕孢屬（Bipolaris）、亞隔孢殼屬（Didymella）、附球菌屬（Epicoccum）、裂褶菌屬（Schizophyllum）、蠟蚧菌屬（Lecanicillium）、漆斑菌屬（Myrothecium）、黑孢霉屬（Nigrospora）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）和根霉屬（Rhizopus）各1種。

圖8 裸燕麥種帶真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of seed borne fungiof naked oat seeds

2.5 真菌毒素的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

通過(guò)對(duì)3種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)樣品按500、100、50、20、8和0.4 ng·mL-1的濃度進(jìn)行檢測(cè)表明，其線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.9995以上，各標(biāo)樣的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表4。

表4 真菌毒素的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)Table 4 Linear equations，linear range and correlation coefficient of mycotoxin

2.6 貯藏年限對(duì)裸燕麥種子真菌毒素含量的影響

通過(guò)對(duì)不同貯藏年限裸燕麥種子的TeA、AFB1和CIT進(jìn)行檢測(cè)表明，不同品種的毒素含量差異明顯，同一品種不同貯藏年限的毒素含量也有顯著差異（表5）。

表5 貯藏年限對(duì)裸燕麥種子真菌毒素含量的影響Table 5 Effect of stor age year s on mycotoxin content of naked oat seeds（μg·kg-1）

TeA含量隨貯藏年限的延長(zhǎng)總體呈先升后降的趨勢(shì)，3個(gè)品種中壩莜9號(hào)的毒素含量相對(duì)最高。白燕2號(hào)貯藏2年時(shí)的TeA含量最高，為116.06μg·kg-1，顯著高于其他3個(gè)貯藏年限（P＜0.05）；貯藏1年時(shí)該毒素的檢出量最低（16.88μg·kg-1），且明顯低于其他材料。壩莜9號(hào)貯藏3年時(shí)該毒素的含量高達(dá)348.67μg·kg-1，是所有處理中最高的；但其在貯藏1年時(shí)檢出量（64.64μg·kg-1）最低，較貯藏3年時(shí)減少了81.46%。壩莜14號(hào)在貯藏2年時(shí)TeA的檢出量最高（123.52μg·kg-1），貯藏5年時(shí)其檢出量最低，為57.26μg·kg-1，較貯藏2年時(shí)下降了53.64%。

AFB1的變化因品種和貯藏年限而異。白燕2號(hào)貯藏1年時(shí)含量最高，為1.04μg·kg-1，是所有處理中最高的；隨后顯著下降，至貯藏5年時(shí)，該毒素的檢出量?jī)H有0.02μg·kg-1，較貯藏1年時(shí)下降了98.08%。壩莜9號(hào)隨貯藏年限的延長(zhǎng)其AFB1含量呈先升后降趨勢(shì)，貯藏2年時(shí)檢出量最高，為0.68μg·kg-1，隨后顯著下降，貯藏5年時(shí)降至最低（0.01μg·kg-1）。壩莜14號(hào)的AFB1含量隨貯藏年限的延長(zhǎng)而下降，貯藏1年時(shí)的含量最高，為0.62 μg·kg-1，隨后急劇下降。

CIT含量隨貯藏年限的增加總體呈先升后降的趨勢(shì)，3個(gè)品種貯藏2年的CIT含量都顯著高于其他年限（P＜0.05）。白燕2號(hào)的CIT含量在貯藏2年后顯著下降，至貯藏5年時(shí)，該毒素的檢出量（0.08μg·kg-1）為所有處理中最低。壩莜9號(hào)在貯藏3年時(shí)的含量較貯藏2年時(shí)下降了91.91%。壩莜14號(hào)在貯藏3年時(shí)的含量最低（0.15 μg·kg-1），除與貯藏5年時(shí)該毒素的檢出量無(wú)明顯差異外，顯著低于其他年限（P＜0.05）。

3 討論

植物種子在生長(zhǎng)、成熟、收獲和貯藏過(guò)程中，難以避免真菌入侵。本試驗(yàn)中，不同貯藏年限參試樣品的帶菌量存在明顯差異，其帶菌量隨貯藏年限的延長(zhǎng)總體呈降低趨勢(shì)，貯藏時(shí)間和品種對(duì)燕麥種子的帶菌量有顯著影響。這與陳燾等［19］對(duì)老芒麥（Elymus sibiricu）種子、雷玉明等［20］對(duì)河西走廊玉米（Zea mays）種子帶菌量的研究結(jié)果類似。金柳艷等［21］研究表明，玉米種子的孢子負(fù)荷量與帶菌率不具有明顯關(guān)聯(lián)性，乳熟期涿州種樣的孢子負(fù)荷量為1448 cfu，帶菌率僅有2.5%；完熟期蚌埠種樣的孢子負(fù)荷量高達(dá)1458 cfu，其帶菌率卻僅有10.0%；新鄭種樣的負(fù)荷量為275 cfu，其帶菌率卻達(dá)到了100.0%。本研究中，燕麥種子的孢子負(fù)荷量和帶菌率的表現(xiàn)趨勢(shì)也不一致，如白燕2號(hào)在貯藏5年時(shí)的孢子負(fù)荷量最高，但其帶菌率卻低于其他年限。貯藏2年的壩莜9號(hào)種子表面的負(fù)荷量在所有貯藏年限中最低，但其帶菌率卻最高。這可能跟貯藏時(shí)間、品種以及真菌寄生能力密切相關(guān)。剛收獲貯藏的種子很容易攜帶其母體及生長(zhǎng)環(huán)境中的真菌體系，隨著貯藏時(shí)間的增加，帶菌量會(huì)因真菌的適應(yīng)性而發(fā)生變化［22］；經(jīng)收獲貯藏的種子，通常會(huì)處于休眠狀態(tài)而不能規(guī)避真菌的侵染，但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，種子自身會(huì)逐漸解除休眠以抵御真菌的進(jìn)一步污染［23］。岳曉禹等［24］對(duì)不同貯藏年限玉米樣品在貯藏過(guò)程中的霉菌群落研究表明，其真菌群落的變化與貯藏時(shí)間的相關(guān)性較強(qiáng)，貯藏1和3年的樣品中真菌群落差異明顯。前人對(duì)芝麻（Sesamum indicum）［25］和棉花（Gossypium hirsutum）種子［26］進(jìn)行真菌檢測(cè)表明，種子外部和內(nèi)部攜帶的真菌種類差異較大。本研究中，裸燕麥種子在不同貯藏年限下內(nèi)部和外部的帶菌量和帶菌種類檢出情況差異顯著。所有參試品種中，白燕2號(hào)種子外部的孢子負(fù)荷量相對(duì)最少，但其帶菌種類卻較多；壩莜9號(hào)的種子內(nèi)部帶菌率相對(duì)最高，但其帶菌種類卻較少。燕麥種子隨貯藏年限的變化其帶菌種類和分離率差異也很大，如壩莜9號(hào)在貯藏1年時(shí)，種子內(nèi)部分離率最高的真菌為阿姆斯特丹曲霉（37.66%），其他年限最高的均為細(xì)交鏈孢，這跟楊顏霞等［27］對(duì)結(jié)縷草(Zoysia japonica)種子的研究結(jié)果類似。這可能跟種子在貯藏期間的自身防御能力和環(huán)境條件有關(guān)，不同真菌的侵染強(qiáng)度有所差異，而且同一品種在不同貯藏年份氣候因子間的差異也會(huì)影響真菌的存活力和繁殖率，進(jìn)而影響對(duì)種子的侵染［11］。

不同品種在不同貯藏年限的種子外部和內(nèi)部攜帶的優(yōu)勢(shì)真菌種類存在明顯差異。如白燕2號(hào)貯藏1年時(shí)種子外部的優(yōu)勢(shì)種為枝狀枝孢菌，2年時(shí)為擬孢鐮孢菌，在3和5年時(shí)均為細(xì)交鏈孢。壩莜9號(hào)貯藏1年時(shí)種子內(nèi)部的優(yōu)勢(shì)菌為阿姆斯特丹曲霉，其他貯藏年限卻是細(xì)交鏈孢。盡管優(yōu)勢(shì)種不同，但優(yōu)勢(shì)屬均為鏈格孢屬、曲霉屬和青霉屬。這和前人對(duì)三七（Panax notoginseng）［28］和紅豆草（Onobrychis viciaefolia）等［29］的種帶真菌研究結(jié)果類似。這主要是由于鏈格孢菌、青霉菌和曲霉菌等腐生菌的寄主范圍通常較廣，可通過(guò)侵染其母本植株、種子及田間雜草進(jìn)行寄生，其孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)也相對(duì)較快，較有利于其在植物組織或器官侵染和傳播［30-31］。本研究發(fā)現(xiàn)，燕麥種子外部和內(nèi)部的真菌情況有所不同，雅致放射毛霉、寄生曲霉、苜蓿莖點(diǎn)霉和米根霉等10種真菌僅在外部檢出，而玉米平臍蠕孢、絲枝蠟蚧菌、稻黑孢菌和短密青霉4種僅在內(nèi)部檢出。共同攜帶的真菌有11種，但其在不同品種或在同一品種不同貯藏年限的分離情況差異也較大。這與趙輝等［25］對(duì)芝麻種子和先米西努爾·肉孜［32］對(duì)苜蓿（Medicago sativa）種子的研究結(jié)果類似，種子經(jīng)消毒前后的真菌檢出情況存在明顯差異。這可能是由于某些真菌對(duì)次氯酸鈉的敏感性較強(qiáng)，外部消毒處理會(huì)破壞其生長(zhǎng)環(huán)境（主要是適宜真菌生長(zhǎng)的酸性環(huán)境）和降低活性，不利于其孢子的萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育，從而抑制真菌的生長(zhǎng)繁殖。

對(duì)燕麥種子攜帶的優(yōu)勢(shì)菌屬代謝產(chǎn)生的危害較大的3種毒素含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)各供試樣品均不同程度地受到3種毒素的污染，其中污染最重的是TeA，其次是CIT和AFB1。這主要是因?yàn)殒湼矜呔N類繁多、適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖力高、寄主范圍廣，95%以上的種都能在植物上寄生，特別是禾谷類農(nóng)作物［33］。王曉紅等［34］對(duì)薏苡（Coix lacryma-jobi）仁在貯藏過(guò)程中的真菌毒素檢測(cè)表明，在貯藏0～30 d時(shí)AFB1含量很低，但在貯藏90 d時(shí)其含量明顯增加。羅曉楊［35］發(fā)現(xiàn)大多數(shù)材料的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和伏馬毒素（fumonisin，F(xiàn)B）含量隨貯藏時(shí)間的變化而變化，在貯藏前期呈降低趨勢(shì)，后期會(huì)增加或先增加后急劇下降，甚至反復(fù)反彈。本研究中，燕麥種子中真菌毒素檢出量差異顯著，隨貯藏年限的變化大多表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)。真菌毒素含量在某一貯藏年份會(huì)顯著高于其他年份，很可能是由于這種毒素的大多數(shù)產(chǎn)毒真菌在這一貯藏時(shí)間達(dá)到了優(yōu)良生長(zhǎng)期，代謝量增大。不同燕麥品種種子的毒素含量差異顯著，同一品種在不同貯藏年限的毒素含量也有明顯差異。如白燕2號(hào)在貯藏1年時(shí)的AFB1含量最高，為1.04μg·kg-1，4年后下降至0.02μg·kg-1；白燕2號(hào)和壩莜9號(hào)在貯藏2年時(shí)的CIT含量顯著高于其他年限，但白燕2號(hào)在貯藏5年時(shí)該毒素的檢出量最低（0.08μg·kg-1），而壩莜9號(hào)在貯藏3年時(shí)的含量最低。這與劉冬梅等［36］對(duì)遠(yuǎn)雜9102和豫花15花生（Arachis hypogaea）中毒素含量的研究結(jié)果類似，在相同的貯藏條件下，不同品種或同一品種的毒素檢出情況會(huì)因貯藏時(shí)間的長(zhǎng)短而存在差異。本試驗(yàn)中，燕麥種子在貯藏期間毒素含量的波動(dòng)除與真菌自身的代謝狀況有關(guān)外，還可能與其所處的貯藏環(huán)境或其他微生物的分解作用有關(guān)。

李儉等［37］研究表明，玉米種子中的AFB1含量隨著生霉粒數(shù)量的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；而DON和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）含量則上下波動(dòng)。盧洋等［38］也發(fā)現(xiàn)，玉米種子帶菌量的多少和毒素檢出量不相關(guān)，不能通過(guò)霉變量直接判斷種子中毒素含量的高低。本研究中，裸燕麥種子中真菌毒素含量的多少與帶菌量未表現(xiàn)出線性關(guān)系，如白燕2號(hào)在貯藏1年時(shí)的TeA含量顯著低于其他3個(gè)年限，僅有16.88μg·kg-1；但其帶菌率顯著高于其他年限，孢子負(fù)荷量也較高。貯藏3年的壩莜9號(hào)AFB1和CIT含量（分別為0.01μg·kg-1和0.11μg·kg-1）都低于其他處理，但其帶菌率和孢子負(fù)荷量（分別為8.50%和4.17 cfu）都較高。種子在貯藏過(guò)程中受真菌侵染的程度與貯藏環(huán)境、真菌自身的代謝狀況、真菌間的分解作用以及種子自身的生理機(jī)制等都有關(guān)系，且其產(chǎn)毒性能不具有均一性［39-40］。本研究中3種真菌毒素含量并未出現(xiàn)同時(shí)增加或降低的情況，這在一定程度上說(shuō)明其產(chǎn)毒真菌并不是同時(shí)生長(zhǎng)繁殖的，這很可能跟燕麥種子在貯藏期間攜帶真菌的多樣性較高，相互之間存在競(jìng)爭(zhēng)性有關(guān)；而且除真菌外的其他微生物（細(xì)菌和放線菌等）及其代謝產(chǎn)物之間都可能發(fā)生拮抗作用而抑制某些真菌的產(chǎn)毒代謝活動(dòng)。

4 結(jié)論

1）貯藏年限對(duì)裸燕麥種子的帶菌量、帶菌種類和分離率以及毒素含量都有顯著影響。帶菌量隨貯藏年限的延長(zhǎng)逐漸下降，毒素含量呈先增后減的趨勢(shì)，帶菌種類和分離率因貯藏時(shí)間的不同差異明顯。

2）裸燕麥種子攜帶的優(yōu)勢(shì)真菌屬為鏈格孢菌屬、曲霉菌屬和青霉菌屬，優(yōu)勢(shì)種因貯藏時(shí)間和品種不同而異。

3）裸燕麥種子的帶菌量與帶菌種類、真菌毒素含量的多少無(wú)明顯相關(guān)性。