RNF2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響*

賈楠，宋哲，陳寶勝，程進(jìn)生

（1.滄州市中心醫(yī)院普外二科，河北滄州061001；2.獻(xiàn)縣人民醫(yī)院，河北滄州062250）

結(jié)直腸癌已成為我國(guó)第3 大常見(jiàn)惡性腫瘤[1]。年齡＞50 歲、有結(jié)直腸癌家族史、相關(guān)消化系統(tǒng)病史及不健康的生活飲食習(xí)慣均是結(jié)直腸癌發(fā)生的高危因素。近年對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為研究較多，大量報(bào)道顯示結(jié)直腸癌生物學(xué)行為可能影響患者抑癌基因、癌基因、血清腫瘤相關(guān)標(biāo)志物及細(xì)胞因子，從而加重疾病發(fā)展[2-3]。研究表明[4]，環(huán)指蛋白2（cyclic finger protein 2,RNF2）具有E3 連接酶活性，對(duì)血管正常發(fā)育、生長(zhǎng)、重塑及細(xì)胞增殖、遷移、侵襲有顯著影響。另RNF2 還可負(fù)反饋影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF） 表達(dá)，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管生成產(chǎn)生抑制作用。國(guó)內(nèi)已有研究證實(shí)RNF2 在食管癌、乳腺癌等腫瘤中均呈異常表達(dá)，且與多種疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。同時(shí)，也有多項(xiàng)研究對(duì)結(jié)直腸癌組織中相關(guān)因子表達(dá)進(jìn)行報(bào)道，并指出其可能參與癌細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程[7-8]。以上均提示RNF2 在癌細(xì)胞侵襲、遷移、血管生成等方面具有顯著影響。但結(jié)直腸癌組織中RNF 的表達(dá)及其臨床意義尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，因此本研究就此展開(kāi)討論，以期為結(jié)直腸癌治療提供新思路和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年6月—2019年6月滄州市中心醫(yī)院收治并確診的62 例結(jié)直腸癌患者的癌組織及距癌旁＞2 cm 正常黏膜組織。其中，男性40例，女性22例；年齡40～79歲，中位年齡65歲，≥65歲38例，＜65歲24 例；發(fā)病部位左39 例，右23 例；乳頭狀腺癌8 例，管狀腺癌40 例，其他腺癌14 例；高分化11 例，中分化35 例，低分化16 例；Dukes 分期A、B 期39 例，C、D 期23 例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38 例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為結(jié)直腸癌且均為腺癌；②入院前未接受放、化療；③臨床資料完整，相關(guān)檢查完善；④入院前無(wú)重大出血史；⑤肝、腎、心功能均正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①預(yù)計(jì)生存期＜2 個(gè)月；②對(duì)治療不耐受；③血標(biāo)本采集困難或標(biāo)本不正確；④過(guò)敏體質(zhì)；⑤合并精神疾病或語(yǔ)言功能障礙。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

取結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織，10%甲醛溶液（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司）固定，經(jīng)梯度濃度酒精（上海譜振生物科技有限公司）脫水，二甲苯（北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司） 透明；采用Arcadia 組織包埋機(jī)（浙江徠卡生物科技有限公司）將組織用石蠟（上海依赫生物科技有限公司）包埋成塊，連續(xù)切成4 μm 厚切片，依次采用二甲苯、沸騰的檸檬酸鈉緩沖液（長(zhǎng)沙達(dá)爾鋒生物科技有限公司）、3%過(guò)氧化氫（上海澤葉生物科技有限公司）進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、梯度酒精水化、PBS 漂洗、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性消除；滴加小鼠抗人RNF2 多克隆抗體（Sino Biological，濃度1∶100）4℃孵育過(guò)夜，PBS 漂洗3 次后滴加通用型二抗（廈門(mén)研科生物技術(shù)有限公司）37℃孵育30 min；再次漂洗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（武漢純度生物科技有限公司），37℃孵育20 min；PBS漂洗，經(jīng)DAB（上海恒斐生物科技有限公司）顯色、蘇木精（上海源葉生物科技有限公司）復(fù)染，脫水，透明，封片，Olympus CX31 光學(xué)顯微鏡（廣州科適特科學(xué)儀器有限公司）下觀察結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中RNF2 表達(dá)。由5年以上臨床經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)科醫(yī)師在不清楚患者資料情況下觀察和判定結(jié)果：著色細(xì)胞染色強(qiáng)弱：0 分無(wú)色，1 分黃色，2 分棕黃色，3 分棕褐色；陽(yáng)性細(xì)胞所占視野百分比：0 分為陽(yáng)性細(xì)胞率≤5%，1 分為陽(yáng)性細(xì)胞率＞5%～25%，2分為陽(yáng)性細(xì)胞率＞25%～50%，3分為陽(yáng)性細(xì)胞率＞50%。兩項(xiàng)評(píng)分之積為最終得分：陰性0～1分，弱陽(yáng)性2分，陽(yáng)性3～4分，強(qiáng)陽(yáng)性5～6分。最終得分≤2 分陰性表達(dá)；最終得分＞2 分陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)

1.3.1 CCK-8 法依次準(zhǔn)備結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116（上海酶研生物科技有限公司），陰性對(duì)照組病毒原液（HCT116-control）與RNF2 過(guò)表達(dá)的病毒原液（HCT116-RNF2）作為3 個(gè)組，傳代培養(yǎng)各組細(xì)胞，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（2×103個(gè)/孔）；待細(xì)胞貼壁后，每孔加入10 μl CCK-8 試劑（上海炎熙生物科技有限公司），37℃孵育0 h、12 h、14 h、36 h、48 h 后在HBS-1096A 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）540 nm 處檢測(cè)各孔光密度（OD）值。

1.3.2 Transwell 細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞使各組細(xì)胞密度約為90%，用200 μl 無(wú)菌槍頭對(duì)孔板培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行劃痕處理，PBS 緩沖液洗滌3 次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，Image J 軟件計(jì)算每個(gè)視野的劃痕面積，細(xì)胞遷移率=（T0時(shí)面積-T24時(shí)面積）/T0時(shí)面積*100%。Transwell：調(diào)整細(xì)胞濃度為5× 105個(gè)/ml，向上室加入細(xì)胞懸液200 μl，向下室加入700 μl 培養(yǎng)基（含有20% FBS），48 h后將Transwell 小室進(jìn)行PBS 清洗，置于甲醛中固定15 min，0.2%結(jié)晶紫（北京百奧萊博科技有限公司）染色20 min，隨機(jī)選取5 個(gè)視野拍照并進(jìn)行技術(shù)統(tǒng)計(jì)；將Transwell 小室上表面鋪適量厚度的基質(zhì)膠，按上述步驟操作，顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中RNF2的表達(dá)

RNF2 主要定位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒（見(jiàn)圖1）；結(jié)直腸癌組織中RNF2 陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常組織（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 免疫組織化學(xué)染色切片圖 （SP×200）

表1 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織RNF2陽(yáng)性表達(dá)率比較 （n=62）

2.2 RNF2 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

不同性別、部位的直腸癌患者的RNF2 表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同年齡、組織學(xué)類(lèi)型、分化程度、Dukes 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的RNF2 表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 結(jié)直腸癌患者不同因素間RNF2表達(dá)陽(yáng)性率的比較例（%）

2.3 過(guò)表達(dá)RNF2對(duì)HCT-116增殖的影響

各組過(guò)表達(dá)RNF2 后12 h、24 h、36 h、48 h 后HCT-116 細(xì)胞OD 值比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的OD 值有差異（F=3 203.034，P=0.000）；②各組OD 值有差異（F=476.864，P=0.000）；③各組OD 值變化趨勢(shì)有差異（F=4 247.089，P=0.000）。見(jiàn)表3。

表3 不同組別與不同時(shí)間的細(xì)胞OD值比較 （±s）

表3 不同組別與不同時(shí)間的細(xì)胞OD值比較 （±s）

組別0 h 12 h 24 h 36 h 48 h HCT116組HCT116-control組HCT116-RNF2組0.33±0.04 0.30±0.04 0.31±0.02 0.49±0.06 0.31±0.03 0.32±0.05 0.48±0.14 0.30±0.06 0.30±0.05 0.77±0.12 0.32±0.05 0.31±0.04 0.96±0.13 0.34±0.04 0.33±0.05

2.4 過(guò)表達(dá)RNF2對(duì)HCT-116遷移的影響

HCT116、HCT116-control、HCT116-RNF2 組HCT116 細(xì)胞劃痕面積，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=35.400，P=0.000）；兩兩比較，HCT116-RNF2 組細(xì)胞劃痕面積大于HCT116-control組、HCT116 組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2 和表4。

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

表4 各組HCT116細(xì)胞遷移率比較（n=10，個(gè)，±s）

表4 各組HCT116細(xì)胞遷移率比較（n=10，個(gè)，±s）

注：①與HCT116 組比較，P ＜0.05；②與HCT116-control 組比較，P ＜0.05。

細(xì)胞遷移率6.65±3.77 45.32±4.05 61.17±4.22①②組別HCT116組HCT116-control組HCT116-RNF2組

2.5 過(guò)表達(dá)RNF2對(duì)HCT116侵襲的影響

HCT116 組、HCT116-control 組、HCT116-RNF2組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)分別為（0.84±0.32）、（0.71±0.27）和（1.32±0.39），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.462，P=0.001）；兩兩比較，HCT116-RNF2 組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)多于HCT116-control組、HCT116組（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 過(guò)表達(dá)RNF2對(duì)HCT116侵襲的影響

3 討論

近年對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的報(bào)道較多，在結(jié)直腸癌組織中癌細(xì)胞的侵襲可經(jīng)病灶部位蔓延至淋巴管，快速擴(kuò)散、增殖至全身[9]。既往多認(rèn)為胚胎發(fā)育及干細(xì)胞自我更新與該病理特性有關(guān)[10]，而目前關(guān)于RNF2 與腫瘤間的關(guān)系報(bào)道較多，學(xué)者提出RNF2 與腫瘤相關(guān)標(biāo)志物、血管纖維化及基因轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程密切相關(guān)[11-12]。

劉建敏等[13]早已指出RNF2 為腫瘤相關(guān)敏感因子，通過(guò)下調(diào)RNF2 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)喉癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到顯著抑制。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)本研究有一定參考價(jià)值，考慮可通過(guò)敲除或下調(diào)RNF2基因判斷其對(duì)生物性特性的影響。本文探究結(jié)直腸癌組織RNF2 表達(dá)與其生物學(xué)特性的相關(guān)性，目前尚未見(jiàn)此類(lèi)相關(guān)報(bào)道，具有一定創(chuàng)新性。本研究顯示結(jié)直腸癌組織中RNF2 表達(dá)水平高于癌旁正常組織，且年齡≥65歲、高、中分化程度，Dulses 分期C、D 期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者RNF2 表達(dá)陽(yáng)性率高，符合既往研究中指出的RNF2 在腫瘤組織中呈高表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)直腸上皮正常細(xì)胞發(fā)生突變后，可通過(guò)刺激肽類(lèi)血管生成因子表達(dá)而產(chǎn)生大量RNF2 蛋白抑制血管形成、重塑及機(jī)體正常組織器官功能維護(hù)。目前已發(fā)現(xiàn)的18 個(gè)多梳蛋白家族（PcGs）成員中RNF2 為其核心成員之一，與PcGs 一樣可通過(guò)表觀遺傳學(xué)事件抑制靶基因活性而參與腫瘤發(fā)生與發(fā)展。RNF2 通過(guò)催化組蛋白賴(lài)氨酸單泛素化造成基因沉默和抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而發(fā)揮促癌作用[14]。另GERGELY 等[15]上調(diào)大鼠RNF2 基因后其內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)異常，血管穩(wěn)定性遭到破壞，且癌細(xì)胞增殖和侵襲能力加強(qiáng)。YANG 等[16]的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)顯示，食管癌鼠敲除RNF2基因后小鼠血管、血管腔變小，毛細(xì)血管減少，內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的聯(lián)系異常。以上實(shí)驗(yàn)均說(shuō)明RNF2 對(duì)血管生成、干細(xì)胞增殖分化和干細(xì)胞自我更新有抑制作用，且可促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展。同時(shí)考慮RNF2過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的黏附減弱，從而提高腫瘤增殖、侵襲能力。為進(jìn)一步探究RNF2過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、增殖、侵襲等生物學(xué)行為的影響，本研究利用過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染HCT-116 細(xì)胞構(gòu)建過(guò)表達(dá)RNF2 的HCT-116 細(xì)胞系并進(jìn)行細(xì)胞增殖、遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)RNF2 后，結(jié)直腸癌細(xì)胞體外遷移、增殖、侵襲能力明顯提高。有研究認(rèn)為RNF2 可能通過(guò)FBXW7基因位點(diǎn)促進(jìn)結(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的發(fā)生[17]。

綜上所述，過(guò)表達(dá)的RNF2 可影響結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為，可為結(jié)直腸癌治療提供新的治療靶點(diǎn)。但由于本研究樣本量少、隨訪(fǎng)時(shí)間短，關(guān)于RNF2 是否可能成為結(jié)直腸癌治療靶點(diǎn)需在臨床研究中進(jìn)一步探討。