外泌體中circ_0044366調(diào)控腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞MMP2的表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究

馬維東，王彤彤，朱啟航，楊海鷗，林 丹

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院胰腺腫瘤科，天津300060

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球癌癥死亡的主要原因之一，CRC發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)［1］。多種危險(xiǎn)因素（如遺傳因素、生活方式、飲食習(xí)慣和環(huán)境影響）均能誘發(fā)CRC的發(fā)生、發(fā)展［2］。盡管最近CRC治療（包括化療和放療）取得了進(jìn)展，但是CRC的預(yù)后仍然相對(duì)較差［3］，導(dǎo)致CRC患者的生存率相對(duì)較低，目前死亡率為12%～87%［4］。轉(zhuǎn)移是CRC患者死亡的主要原因［5］，其中肝轉(zhuǎn)移約占這些死亡的60%［6-7］，因此與CRC轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子生物標(biāo)志物的鑒定對(duì)于CRC的后續(xù)治療和延長(zhǎng)患者生存期至關(guān)重要。

外泌體是一種納米級(jí)的（30～100 nm）細(xì)胞外囊泡，可由大多數(shù)類型的細(xì)胞分泌，并在體液（如血液、尿液、唾液和母乳）中循環(huán)［8］。近年來，有研究［9］表明，外泌體在CRC的進(jìn)展中作用廣泛。外泌體內(nèi)容物廣泛，可包裹各種生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸，以及環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）、miRNA等非編碼RNA，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞中。circRNA是一種新型的具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性RNA［10］。在細(xì)胞中，circRNA不僅可以與miRNA或蛋白質(zhì)結(jié)合以發(fā)揮各種功能［11］，而且可以與其他核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)一起被分選進(jìn)入細(xì)胞外囊泡中。外泌體從細(xì)胞分泌到體液中，circRNA通過體液開始其循環(huán)并激活其生物學(xué)功能。

目前有多項(xiàng)研究［12-14］發(fā)現(xiàn)，circRNA作為miRNA分子海綿參與CRC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等病理生理學(xué)過程，并且某些circRNA作為miRNA分子海綿與CRC放療敏感性有關(guān)。circ＿0055625通過吸附miR-106b-5p，抑制其發(fā)揮功能，間接激活I(lǐng)TGB8信號(hào)通路，從而促進(jìn)CRC的進(jìn)展［15］。還有研究［16］表明，circRAE1通過結(jié)合miR-338-3p影響TYRO3的表達(dá)，顯著促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移和侵襲。因此，circRNA/miRNA/靶基因/靶蛋白軸可能是CRC發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一?；|(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）是一種具有Ⅳ型膠原降解特性的蛋白質(zhì)［17］。本研究旨在探討CRC細(xì)胞分泌外泌體包裹的circ_0044366轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblast，CAF）中，通過吸附miR-29b對(duì)CRC侵襲及轉(zhuǎn)移的影響及其可能的作用機(jī)制，為尋找CRC侵襲和轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物提供有意義的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)抽取2018年1月—2019年12月就診于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院的46例CRC患者血清樣本及同期收治的46例非癌癥人群（對(duì)照組）血清樣本（表1）。所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為CRC，且在取樣前未接受任何癌癥相關(guān)治療。

表1 46例CRC患者臨床病理學(xué)特征Tab.1 Clinicopathological features of 46 CRC patients［n (%)］

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 外周血清標(biāo)本

所有血清樣本抽取均在清晨空腹條件下，收集血清于抗凝管中于4℃保存，并在2h內(nèi)以1 900×g離心15 min。離心后取上清液于除酶1.5 mL Ependorf試管內(nèi)并置于-80℃冰箱中保存。所有血清的采集均征得癌癥患者和非癌癥人群的知情同意，符合人體試驗(yàn)委員會(huì)制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并獲得天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的認(rèn)可。

1.2.2 組織標(biāo)本

收集手術(shù)切除的CRC患者的腫瘤組織標(biāo)本及配對(duì)癌旁標(biāo)本共40對(duì)，其中男性24例，女性16例。所有標(biāo)本的留存均獲得患者及其家屬的知情同意，符合人體試驗(yàn)委員會(huì)制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并獲得天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的認(rèn)可。

1.2.3 細(xì)胞系

CRC細(xì)胞系SW480、HCT116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心。CRC組織來源的CAF和正常成纖維細(xì)胞（normal fibroblast，NF）從CRC患者的癌組織及癌旁組織中分離得到。

1.2.4 常規(guī)試劑和耗材

含有miR-29b結(jié)合區(qū)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒p-circ-MIR-29b由金斯瑞生物科技股份有限公司構(gòu)建，含有circ_0044366過表達(dá)或circ_0044366 shRNA序列的慢病毒及質(zhì)粒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，miR-29b mimics/inhibitor以及相應(yīng)對(duì)照均由廣州銳博生物技術(shù)有限公司質(zhì)控合成，抗MMP2抗體、抗CD63抗體、抗TSG101抗體、抗Alix抗體、抗GAPDH抗體、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，抗α-SMA抗體、抗FAP抗體、抗FSP1抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，TRIzol RNA提取試劑盒購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）相關(guān)引物均由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，PKH26膜染料試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SW480和HCT116細(xì)胞系均培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，CAF和NF細(xì)胞系培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基中。細(xì)胞置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫、恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 外泌體提取

將細(xì)胞培養(yǎng)液吸入離心管并按如下梯度離心：4 ℃條件下，1 000×g離心10 min，3 000×g離心30 min，10 000×g離心60 min，100 000×g離心70 min。從沉淀中收集外泌體并重懸于磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）中。提取的外泌體懸液可放置于4 ℃下保存3 d并盡快使用。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

采用放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定實(shí)驗(yàn)樣本蛋白濃度，定量后30 μg蛋白上樣十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉常溫封閉1h，分別與抗MMP2抗體（1∶500）、抗CD63抗體（1∶2 000）、抗TSG101抗體（1∶1 000）、抗Alix抗體（1∶1 000）和抗GAPDH抗體（1∶3 000）在4 ℃下溫育過夜。過夜后用洗膜緩沖液（tris buffered saline Tween，TBST）洗膜。室溫下溫育相應(yīng)二抗1 h，電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）顯影曝光并采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將培養(yǎng)皿中細(xì)胞消化重懸后以適宜密度接種到6孔板中，細(xì)胞充分貼壁且融合度為60%～70%時(shí)按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司）說明書的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.5 RNA提取及RTFQ-PCR

按廠家說明書使用TRIzol 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司）從培養(yǎng)的細(xì)胞和組織中提取總R N A，然后將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用SYBR Green Ⅰ RTFQ-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞mi R-29 b和MMP2 mRNA的 表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)如下：MMP2上游引物為5’-AAGGCGTTAGTTCTTCGGGG-3’，下游引物為5’-CACCTTTTGCTCCACAGTGC-3’；circ_0044366上游引物為5’-GCTGG GGTGTGTTAAGCTTT-3’，下游引物為5’-ACCC ACGTGTCCTTAGAGAA-3’；GAPDH上游引物為5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物為5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s為1個(gè)循環(huán)，共35個(gè)循環(huán)；最后1個(gè)循環(huán)72 ℃延伸2 min，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔并重復(fù)3次。每組miR-29b和MMP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平按公式2-ΔΔCt計(jì)算。

1.3.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

將細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞貼壁后待轉(zhuǎn)染；將含有miR-29b潛在結(jié)合位點(diǎn)的MMP2 3’非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒及結(jié)合位點(diǎn)突變的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（1 μg/孔），與miR-29b mimics、miR-29b inhibitors（100 pmol/孔）分別進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，另分別各設(shè)1個(gè)對(duì)照組，總計(jì)6組；轉(zhuǎn)染4～6 h后換液為完全培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)結(jié)束后，用熒光素酶檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司）檢測(cè)各組熒光素酶表達(dá)水平（依照說明書操作）；操作中的吸光度（D）值用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)量，以載體熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒催化底物產(chǎn)生的熒光活性作為參照，最終分析相對(duì)熒光活性。

1.3.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞懸液加入到24孔板中，待貼壁且密度合適時(shí)換用2%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的條件培養(yǎng)基，并向培養(yǎng)基中添加40 μL外泌體與細(xì)胞共培養(yǎng)，48 h后吸棄培養(yǎng)基并用PBS清洗細(xì)胞3次，向孔板內(nèi)加入500 μL 4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 min，PBS清洗；用10%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉液封閉2 h，取出封閉液，將按1∶250配制的一抗稀釋液加入24孔板中，4 ℃搖床溫育過夜；PBS洗滌后加入按1∶1 000配制的二抗稀釋液，室溫?fù)u床溫育1 h；PBS洗滌后將用PBS按1∶1 000配制的Hochest稀釋液加入24孔板中，室溫溫育10 min；PBS洗滌后用抗淬滅劑封片于共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.8 免疫組織化學(xué)染色

將石蠟包埋切片脫蠟、水化，PBS洗2次，每次5 min，3%H2O2室溫封閉5～10 min，蒸餾水洗3次，每次5 min，然后進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗5 min，BSA室溫封閉20 min。滴加一抗于4 ℃下溫育過夜，PBS洗3次，每次2 min；滴加生物素化二抗，20～37 ℃下20 min，PBS洗3次，每次2 min，滴加試劑SABC，20～37 ℃下20 min，PBS洗4次，每次5 min，然后進(jìn)行DAB顯色試劑盒顯色；蒸餾水洗3次，每次5 min，然后使用蘇木精復(fù)染2 min、鹽酸乙醇分化；脫水、透明、封片、鏡檢。

1.3.9 PKH26染色

本研究采用PKH26膜染料試劑盒染色外泌體膜，用于觀察與追蹤外泌體能夠成功進(jìn)入受體細(xì)胞中。將按超速離心法提取的外泌體沉淀用100 μL Diluent C試劑充分重懸（A液）；另取100 μL Diluent C試劑，向其中加入0.4 μL PKH26染料，充分混勻（B液）；用移液器將A液與B液充分混合，于室溫下共同溫育15 min后向其中加入200 μL血清，并在室溫下共同溫育1 min以中止染色；用PBS清洗上述外泌體1次，后加入適量新PBS重懸備用。

1.3.10 裸小鼠荷瘤模型的建立

將BALB/c裸小鼠（6～8周齡）隨機(jī)分組并標(biāo)記，將SW480細(xì)胞、穩(wěn)定過表達(dá)circ_0044366（circ_0044366-overexpression，circ_0044366-O E）的SW480細(xì)胞及敲低circ_0044366（circ_0044366-knockdown，circ_0044366-KD）的SW480細(xì)胞充分?jǐn)U增，分別將上述細(xì)胞系的單細(xì)胞懸液（每只裸小鼠1×107細(xì)胞）以皮下注射的方式接種到裸小鼠中，與未移植瘤裸小鼠共計(jì)4組飼養(yǎng)在無病原體的動(dòng)物設(shè)施中，可隨意進(jìn)食。定期觀察裸小鼠狀態(tài)并記錄皮下成瘤生長(zhǎng)情況。在移植瘤后的第48天處死裸小鼠，并取裸小鼠肝臟，計(jì)數(shù)肝臟轉(zhuǎn)移瘤個(gè)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC血清外泌體中circRNA的鑒定

使用超速離心法從CRC患者和非癌癥人群中分離出的血清外泌體，在透射電子顯微鏡下顯示為膜性囊泡狀結(jié)構(gòu)，中央凹陷，直徑約為100 nm（圖1A）。接下來檢測(cè)外泌體的特異性表面蛋白TSG101、Alix和CD63，詳見圖1B。綜上可知，細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)超速離心法得到的顆粒符合外泌體所報(bào)道的重要特征，可確認(rèn)成功分離外泌體，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)1組外泌體circRNA在CRC患者血清外泌體中與非癌癥人群血清外泌體中的表達(dá)具有高度差異性（圖1C），CRC組中95個(gè)circRNA顯著上調(diào)（倍數(shù)變化＞4），94個(gè)circRNA明顯下調(diào)（變化倍數(shù)＜0.25），其中CRC組外泌體中的Has_circ_0044366比非癌癥人群組高124倍，后續(xù)研究主要圍繞circ_0044366展開。RTFQ-PCR結(jié)果顯示，circ_0044366在正常人外泌體中表達(dá)較低，而在CRC患者血清外泌體中高表達(dá)（P＜0.05，圖1D）。

圖1 CRC血清外泌體中circRNA的鑒定Fig.1 Identification of circRNA in serum exosomes of CRC

2.2 建立轉(zhuǎn)染SW480外泌體的CAF細(xì)胞系

腫瘤微環(huán)境由多種細(xì)胞類型組成，其中CAF占間質(zhì)細(xì)胞的比例最大。分離腫瘤組織中的CAF和癌旁組織中的NF，免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，CAF組α-SMA、FAP和FSP1各項(xiàng)指標(biāo)均明顯高于NF組（圖2A）。將SW480細(xì)胞外泌體與CAF細(xì)胞共溫育，并采用PKH26對(duì)外泌體進(jìn)行染色標(biāo)記并進(jìn)行追蹤，PKH26標(biāo)記的SW480細(xì)胞外泌體成功進(jìn)入受體細(xì)胞CAF中（圖2B），并且在透射電子顯微下觀察到SW480細(xì)胞外泌體（SW480 exosomes，480 exos）（圖2C）。接下來檢測(cè)CAF、SW480和HCT116細(xì)胞系的外泌體中circ_0044366的表達(dá)水平。RTFQ-PCR結(jié)果顯示，480 exos和HCT116來源外泌體（HCT116 exosomes，116 exos）中circ_0044366高表達(dá)，而在CAF來源外泌體組（CAF exosomes，CAF exos）中circ_0044366顯著低表達(dá)（P＜0.05，圖2D）。選取circ_0044366表達(dá)最高的SW480細(xì)胞系，分別用0.9%NaCl溶液（saline）、480 exos、circ_0044366敲低的SW480細(xì)胞外泌體（circ_0044366-deleteSW480 exosomes，480 exos circ_0044366 del）與CAF共培養(yǎng)后進(jìn)行RTFQ-PCR，結(jié)果顯示，saline組及480 exos circ_0044366 del組中circ_0044366含量均較低，而480 exos組circ_0044366含量明顯升高（P＜0.05，圖2E）。

圖2 建立轉(zhuǎn)染SW480外泌體的CAF細(xì)胞系Fig.2 Establishment of CAF cell line transfected with 480 exos

2.3 circ_0044366與miR-29b直接相互作用

通過生信分析確定了circ_0044366與miR-29b之間存在的兩個(gè)靶點(diǎn)（圖3A）。經(jīng)TargetScan數(shù)據(jù)庫（http://www.targetscan.org/）、DAⅤID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）交叉驗(yàn)證miR-29b具有調(diào)控MMP2表達(dá)的潛在作用，預(yù)測(cè)了在MMP2 mRNA中miR-29b的3’-UTR結(jié)合區(qū)（圖3B）。免疫組織化學(xué)分析表明，在CRC組織中MMP2高表達(dá)，而在癌旁組織中低表達(dá)（P＜0.05，圖3C）。接下來進(jìn)一步鑒定CRC細(xì)胞外泌體circ_0044366與MMP2蛋白之間的臨床相關(guān)性：用RTFQ-PCR測(cè)定外泌體中的circ_0044366表達(dá)水平，用Western blot和灰度分析相結(jié)合的方法對(duì)MMP2蛋白進(jìn)行定量，結(jié)果顯示，在CRC血清外泌體中circ_0044366的表達(dá)水平與MMP2蛋白的表達(dá)水平呈正相關(guān)（P＜0.05，圖3D）。用同樣的方法測(cè)定MMP2 mRNA的表達(dá)水平和MMP2的表達(dá)水平，兩者無顯著相關(guān)性（P＞0.05，圖3E），因此推測(cè)circ_0044366通過轉(zhuǎn)錄后途徑調(diào)控MMP2的表達(dá)。

圖3 circ_0044366與miR-29b的直接相互作用Fig.3 Direct interaction of circ_0044366 with miR-29b

2.4 circ_0044366和MMP2可靶向結(jié)合miR-29b

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miR-29b可以顯著抑制circ_0044366和MMP2 mRNA 3’-UTR野生型質(zhì)粒的熒光強(qiáng)度（P＜0.05），而對(duì)circ_0044366和MMP2 mRNA 3’-UTR突變型質(zhì)粒的熒光強(qiáng)度無明顯抑制作用（P＞0.05，圖4A、B）。抑制miR-29b可以顯著促進(jìn)circ_0044366和MMP2 mRNA 3’-UTR野生型質(zhì)粒的熒光強(qiáng)度（P＜0.05），但對(duì)circ_0044366和MMP2 3’-UTR突變型質(zhì)粒的熒光強(qiáng)度無明顯促進(jìn)作用（P＞0.05），證明circ_0044366靶向結(jié)合miR-29b，而miR-29b對(duì)MMP2 mRNA的3’-UTR區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。Western blot結(jié)果顯示，與480 exos共培養(yǎng)的CAF細(xì)胞中MMP2蛋白的表達(dá)水平升高，而與480 exos circ_0044366 del共培養(yǎng)的CAF中MMP2的表達(dá)水平降低（圖4C），證明480 exos介導(dǎo)的circ_0044366可以增強(qiáng)CAF中MMP2蛋白的表達(dá)水平。向CAF細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-29b mimics抑制了MMP2蛋白的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitors則促進(jìn)了MMP2的表達(dá)（圖4D、F），但對(duì)MMP2的mRNA水平無明顯影響（P＞0.05，圖4E），證明miR-29b可以通過轉(zhuǎn)錄后途徑抑制MMP2蛋白的表達(dá)水平。接下來在CAF細(xì)胞中進(jìn)行了細(xì)胞功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，circ_0044366-OE組MMP2蛋白的表達(dá)水平顯著升高且可被miR-29b mimics逆轉(zhuǎn)，circ_0044366-KD組MMP2蛋白的表達(dá)水平顯著降低且可被miR-29b inhibitors逆轉(zhuǎn)（圖4H），但對(duì)MMP2的mRNA水平無明顯影響（P＞0.05，圖4G）。

圖4 circ_0044366靶向調(diào)控miR-29b，miR-29b靶向調(diào)控下游的MMP2Fig.4 circ_0044366 regulated miR-29b,which targeted downstream MMP2

2.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circ_0044366促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)

為進(jìn)一步評(píng)估circ_0044366對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響，本研究建立了裸小鼠移植瘤模型，共計(jì)4組（圖5A），培養(yǎng)期間每隔8 d測(cè)量各組裸小鼠荷瘤的直徑（圖5B）。此外，分別提取4組裸小鼠的血清外泌體（圖5C），RTFQ-PCR結(jié)果顯示，circ_0044366-KD組中血清外泌體circ_0044366含量降低，而在circ_0044366-OE組中顯著增多（圖5D）。同時(shí)，circ_0044366-KD組瘤體中circ_0044366含量及MMP2蛋白的表達(dá)水平降低，而circ_0044366-OE組瘤體中circ_0044366含量及MMP2蛋白的表達(dá)水平顯著升高（圖5E、G），兩組中MMP2的mRNA水平無明顯差異（圖5F）。

圖5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)circ_0044366與miR-29b及MMP2的相互作用Fig.5 In vivo experiments confirmed the interaction of circ_0044366 with miR-29b and MMP2

2.6 體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型驗(yàn)證下調(diào)circ_0044366抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移

同時(shí)，本研究對(duì)裸小鼠移植瘤模型進(jìn)行手術(shù)取出完整的肝組織，分別計(jì)數(shù)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的個(gè)數(shù)。其中，circ_0044366-OE組裸小鼠全部出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移（6/6），平均轉(zhuǎn)移瘤為5.5個(gè)，數(shù)量顯著多于對(duì)照組，而circ_0044366-KD組中出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移的裸小鼠模型僅占本組總數(shù)的33.3%（2/6），平均轉(zhuǎn)移瘤為1.5個(gè)，顯著少于對(duì)照組，證明敲低circ_0044366能夠顯著減少CRC肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生（圖6）。

圖6 體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型驗(yàn)證circ_0044366對(duì)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用Fig.6 In vivo metastasis model verifies the effect of circ_0044366 on tumor invasion and metastasis

綜上，本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)，從體內(nèi)外均證明了CRC細(xì)胞中circ_0044366能夠通過外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)至CAF細(xì)胞中，通過吸附miR-29b上調(diào)MMP2的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)CRC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。該跨細(xì)胞信號(hào)通路包括circ_0044366、miR-29b及MMP2及其相互之間的聯(lián)系，在調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中的發(fā)揮重要作用（圖7）。

圖7 circ_0044366調(diào)控CAFMMP2釋放并促進(jìn)CRC進(jìn)展的機(jī)制模型Fig.7 Mechanism model of circ_0044366 regulating MMP2 release from fibroblasts and promoting CRC progression A proposed model illustrating the role of CAF-derived exosomal circ_0044366 in regulating ferroptosis in CAF and promoting CRC invasion and metestasis

3 討論

circRNA是一種非編碼RNA，其對(duì)核酸外切酶介導(dǎo)的降解具有抗性，是穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并且在各種細(xì)胞類型中普遍表達(dá)［18］。這些circRNA通常用作競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA來影響下游miRNA的功能［19］。研究［20］表明，circRNA在外泌體中富集和穩(wěn)定，可以在循環(huán)血液和尿液中檢測(cè)到。外泌體可以被包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的許多類型的細(xì)胞所接受，還可以充當(dāng)細(xì)胞間的信使，細(xì)胞可以通過外泌體來轉(zhuǎn)移circRNA。

隨著微陣列和RNA測(cè)序技術(shù)的顯著進(jìn)步，已發(fā)現(xiàn)越來越多的circRNA在眾多疾病過程中起著至關(guān)重要的作用，尤其是在包括CRC在內(nèi)的癌癥。有研究［21］證明，circIFT80促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），在circIFT80過表達(dá)的情況下，CRC細(xì)胞的侵襲和遷移顯著增加，與E-鈣黏著蛋白表達(dá)下降以及波形蛋白和N-鈣黏著蛋白表達(dá)增加有關(guān)。一項(xiàng)針對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的研究［13］表明，cir-ITCH對(duì)miRNA具有吸附作用，提高cir-ITCH水平會(huì)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。也有越來越多的證據(jù)表明，外泌體circRNA在CRC的腫瘤生長(zhǎng)［9-10］、免疫逃逸［27］、血管生成［22］、轉(zhuǎn)移［23］和耐藥性形成［24］中發(fā)揮關(guān)鍵作用。從血液樣本中收集的外泌體已顯示出在疾病早期的診斷潛力，TNM階段特異性的預(yù)后潛力以及對(duì)CRC中常見的化療藥物和聯(lián)合用藥即5-FU和FOLFOX的預(yù)測(cè)潛力，且已經(jīng)證明外泌體circRNA比單獨(dú)的癌胚抗原和糖類抗原19-9具有更高的敏感性和特異性［25］。

本研究探索了circ_0044366在CRC侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，并證明在CRC患者血清外泌體中circ_0044366的含量顯著高于正常血清外泌體。通過熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)證實(shí)，circ_0044366靶向結(jié)合miR-29b，且miR-29b與MMP2蛋白的表達(dá)水平明顯相關(guān)。本研究首先發(fā)現(xiàn)外泌體介導(dǎo)的circ_0044366能夠促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移，通過外泌體進(jìn)行跨細(xì)胞通訊，顯著促進(jìn)CRC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

MMP2存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，是一種具有Ⅳ型膠原降解特性的蛋白質(zhì)，其催化位點(diǎn)中含有3個(gè)纖維連接蛋白Ⅱ型重復(fù)序列，使變性Ⅳ型膠原和Ⅴ型膠原與彈性蛋白結(jié)合。研究［26-29］表明，MMP2的表達(dá)與CRC、肺癌、甲狀腺乳頭狀癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、膀胱癌等多種癌癥進(jìn)展相關(guān)。

綜上，本研究表明，敲低CRC細(xì)胞中的circ_0044366有望通過調(diào)控miR-29b/MMP2軸來抑制CRC的侵襲和轉(zhuǎn)移，為探尋診治CRC轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物提供了有意義的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為治療轉(zhuǎn)移性CRC提供了新的跨細(xì)胞通訊調(diào)控思路，開啟了新的研究角度，其在轉(zhuǎn)移性CRC的生物標(biāo)志物診斷、預(yù)后判斷以及從抑制轉(zhuǎn)移的角度延長(zhǎng)患者生存期和提高患者生存質(zhì)量方面均具有重要意義。