miR-596在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

尹貴彬，金春明，李亞南，宮方巖，張?chǎng)┉?/p>

(牡丹江醫(yī)學(xué)院1.研究生處；2.附屬紅旗醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 牡丹江 157011)

乳腺癌是一組多基因的異質(zhì)性腫瘤疾病，發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響女性的身心健康[1]。乳腺癌早期的診斷效能對(duì)提高患者的預(yù)后生存期至關(guān)重要，傳統(tǒng)的血清腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、糖蛋白抗原153(carbohydrate antigen153，CA153)的敏感度和特異性較差[2]，臨床上常用的乳腺鉬靶X線(xiàn)對(duì)女性身體具有一定的放射性危害，所以需要靈敏度更高、特異性更好和更為安全的乳腺癌腫瘤標(biāo)志物用于乳腺癌的早期診斷及治療。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種非編碼RNA，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡過(guò)程中起著重要調(diào)節(jié)作用，參與細(xì)胞的生命活動(dòng)[3]，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著致癌或抑癌作用。目前國(guó)內(nèi)外研究表明，miR-596在多種惡性腫瘤中均有異常表達(dá)，但鮮有miR-596在乳腺癌患者診斷中的報(bào)道。本研究旨在通過(guò)探討miR-596在乳腺癌組織中的表達(dá)及其與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，為乳腺癌的早期臨床診斷提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集自2019年3月至2019年12月間牡丹江市腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的乳腺癌癌組織、癌旁正常組織各40例，新鮮標(biāo)本置于液氮中轉(zhuǎn)運(yùn)，放入-80 ℃冰箱保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均經(jīng)病理組織活檢確診為乳腺癌；(2)臨床病歷資料完整；(3)所有患者術(shù)前均未接受放療化療、免疫治療等措施；(4)年齡大于18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有慢性疾病及其他腫瘤患者；(2)精神疾病患者；(3)非女性患者。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)乳腺癌TNM分期第八版對(duì)患者進(jìn)行Ⅰ～Ⅳ期分期。根據(jù)WHO(2012版)乳腺腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，由兩位病理科醫(yī)師對(duì)所有病例進(jìn)行病理診斷。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑和設(shè)備總RNA提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen)、Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen)、Master Mix檢測(cè)試劑盒(德國(guó)Roche公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo)、PCR引物(上海生工)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo FisherQuantstudio3)；兔抗人多克隆抗體、ER、PR、Her-2、Ki-67單克隆抗體及二抗試劑盒(福州邁新)，孵育盒(福州邁新BOX-1001)、染色缸(福州邁新RAK-3001)、切片盒(福州邁新BOX-3001)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏GNP-9080)，顯微鏡(奧林巴斯CX41)。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取 取組織標(biāo)本于研缽中加入液氮研磨成粉末，取50～100 mg組織粉末加入1 mL的Trizol液的EP管中，冰上勻漿1～2 min，室溫放置5 min；加入200 μL的氯仿，蓋緊EP管并劇烈搖蕩15 s；室溫放置3 min，待溶液分層后，4 ℃、11750 g離心10 min；取上層無(wú)色液相于一新的EP管中，加入500 μL異丙醇，溫和顛倒混勻。室溫放置10 min，4 ℃、11750 g離心10 min；棄去上清液，加入1 mL的75%乙醇，渦旋混勻，4 ℃下11750 g離心5 min，重復(fù)操作一次；棄上清，室溫干燥5～10 min(去除乙醇)，加入30 μL RNase-Free H2O溶解RNA。微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度,吸光度比值>1.8符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 miR-596檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)患者組織中miR-596的表達(dá)情況，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將獲取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在Real-time PCR儀上對(duì)miR-596進(jìn)行擴(kuò)增，以U6為內(nèi)參。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL：RNA sample 10 μL，10XRT Buffer 2.0 μL，25 X dNTP Mix(100mM) 0.8 μL，10XRT Randon Primers 2.0 μL，MμLtiScribeTM Reverse Transcriptase 1.0 μL，RNase inhibitor 1.0 μL，Nuclease-free H2O 3.2 μL；反應(yīng)條件25 ℃ 30 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min。擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL：2XAllinOneTMQ-PCR Mix 10 μL，cDNA template 1.0 μL(100 ng/μL)，Nuclease-free H2O 7.0 μL，PCR特異引物F(10 μM)1.0 μL，PCR特異引物R(10 μM)1.0 μL；反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)數(shù)。采用ΔΔCт的相對(duì)定量：各樣品目的基因miR-596和內(nèi)參基因U6的CT值直接由儀器生成。每個(gè)樣品的目的基因濃度除以其內(nèi)參基因的濃度，以N=2-△CT表示標(biāo)本miR-596的相對(duì)表達(dá)量,其中△CT=CTmiR-596-CTU6。

1.3.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體-2(Her-2)、雌激素受體(ER)及孕激素受體(PR)、增殖細(xì)胞核抗原(Ki-67) 患者乳腺癌組織手術(shù)標(biāo)本，先用10%福爾馬林溶液進(jìn)行固定，再行常規(guī)脫水，石蠟包埋切片處理，切片厚度4 um，HE染色鏡下觀(guān)察。免疫組織化學(xué)染色，一抗分別為ER、PR、Her-2、Ki-67；以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。ER、PR及Ki-67定位于癌細(xì)胞核，有淡黃、棕黃或棕褐色顆粒為陽(yáng)性；Her2定位于細(xì)胞膜，有棕黃色顆粒為陽(yáng)性；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色程度和百分率進(jìn)行半定量分析。(-):無(wú)顯色反應(yīng)；(+):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%，染色呈棕黃色；(++):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%～50%，染色呈棕黃或棕色；(+++):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%，染色呈棕色或深棕色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，miR-596的相對(duì)表達(dá)水平以中位數(shù)和四分位數(shù)表示，即M(P25，P75)表示。配對(duì)樣本間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組獨(dú)立樣本間比較采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)，多組獨(dú)立樣本間比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織中miR-596的相對(duì)表達(dá)水平miR-596在乳腺癌組中表達(dá)水平顯著低于乳腺癌癌旁組織中的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 miR-596在乳癌腺癌組織及癌旁組織的相對(duì)表達(dá)水平[M(P25，P75)]

2.2 miR-596相對(duì)表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系miR-596在乳腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期及Ki-67表達(dá)有關(guān)(P<0.01)，與患者的年齡、Her-2、ER及PR的表達(dá)均無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 miR-596相對(duì)表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系[M(P25，P75)]

2.3 miR-596相對(duì)表達(dá)水平與TNM分期及Ki-67間的相關(guān)性分析通過(guò)Spearman秩相關(guān)分析,miR-596相對(duì)表達(dá)水平與TNM分期呈負(fù)相關(guān)(r=-0.599，P<0.001)見(jiàn)圖1。miR-596相對(duì)表達(dá)水平與Ki-67呈相關(guān)(r=-0.891，P<0.001)，見(jiàn)圖2。

圖1 miR-596相對(duì)表達(dá)水平與乳腺癌TNM分期之間的相關(guān)性

圖2 miR-596相對(duì)表達(dá)水平與乳腺癌Ki-67之間的相關(guān)性

3 討論

microRNA-596(miR-596)位于人染色體8p23.3上，是一種基因間miRNA基因[4]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，miR-596與腫瘤的發(fā)病機(jī)制具有密切的相關(guān)性[5-6]，miR-596在多種癌癥中起著抑癌作用，而其在乳腺癌中的功能和作用仍缺乏研究。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了miR-596在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)水平，相對(duì)于癌旁正常組織，miR-596在乳腺癌組織中相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明miR-596低水平表達(dá)可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系，為乳腺癌的診斷提供了一個(gè)潛在的分子診斷標(biāo)志物，但是該作用機(jī)制還不夠明確，需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

為了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-596在乳腺癌發(fā)展中的作用，結(jié)合miR-596與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-596在乳腺癌組織中的表達(dá)與與患者的年齡、Her-2、ER及PR的表達(dá)均無(wú)關(guān)(P>0.05)，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期及Ki-67表達(dá)有關(guān)(P<0.01)。在40例乳腺癌患者中，miR-596在腫瘤大小<2 cm的患者中表達(dá)水平顯著高于腫瘤大小>2 cm的患者，miR-596在未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中表達(dá)水平顯著高于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。同時(shí)通過(guò)miR-596與TNM分期及Ki-67間的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)miR-596水平與TNM分期負(fù)相關(guān)(r=-0.599,P<0.001),miR-596與Ki-67負(fù)相關(guān)(r=-0.891，P<0.001)，這與結(jié)果中miR-596表達(dá)水平隨著TNM分期增加表達(dá)水平降低和miR-596表達(dá)水平在Ki-67陽(yáng)性的乳腺癌組織中低一致。人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體-2(Her-2)、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及增殖細(xì)胞核抗原(Ki-67)是乳腺癌常用的免疫組化指標(biāo)，ER和PR與乳腺癌的惡性程度負(fù)相關(guān)[7-8]，Her-2陽(yáng)性表達(dá)率越高患者預(yù)后越差[9]；Ki67陽(yáng)性表率達(dá)越高，癌細(xì)胞增殖活性越高，預(yù)后越差[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-596與Her-2、ER及PR的表達(dá)均無(wú)關(guān)(P>0.05)，與Ki-67表達(dá)有關(guān)(P<0.01)。本研究中mi-596在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中低表達(dá)，并隨著TNM分期增加表達(dá)水平逐漸降低，為mi-596在乳腺癌中的作用提供更進(jìn)一步的依據(jù)。同時(shí)通過(guò)miR-596與Ki-67的相關(guān)性分析，表明miR-596與Ki-67之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.891，P<0.001)，miR-596表達(dá)水平越低，Ki67陽(yáng)性表率達(dá)越高，提示患者預(yù)后越差。

綜上所述，miR-596可能在乳腺癌中起著抑癌作用，若能夠通過(guò)更深入的靶基因預(yù)測(cè)技術(shù)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，更進(jìn)一步的研究miR-596在乳腺癌中的作用機(jī)制，有望為乳腺癌的診治提供一個(gè)新的思路與研究靶點(diǎn)。