急性缺血性腦卒中患者血漿miR let-7b-3p水平及意義

張彩玲

(平頂山市第二人民醫(yī)院急診科，河南 平頂山 467000)

腦卒中因其高發(fā)病率、高致死率及高致殘率而受到國內(nèi)外臨床研究人員的關(guān)注[1]。急性缺血性腦卒中約占所有腦卒中患者的80%，最新研究顯示，我國急性缺血性腦卒中發(fā)病率約為1.5%，每年新增卒中患者1643/10萬人[2]。急性缺血性腦卒中發(fā)病迅速，易造成患者神經(jīng)功能損傷及腦組織死亡。因此，急性缺血性腦卒中的防治工作備受臨床醫(yī)師的關(guān)注。急性缺血性腦卒中的病情發(fā)展是由脂質(zhì)代謝、糖代謝紊亂等多種因素共同作用的結(jié)果[3]。此前有研究應(yīng)用超敏C反應(yīng)蛋白、白介素-6及紅細(xì)胞分布寬度等預(yù)測急性缺血性腦卒中患者預(yù)后[4-5]，但上述指標(biāo)易受外界因素的影響，如炎癥、貧血等因素，因此特異性均較低，預(yù)測價(jià)值十分有限。動物試驗(yàn)表明，miR let-7b-3p在頸總動脈閉塞引起的急性缺血性腦卒中大鼠中表達(dá)升高，并可通過調(diào)節(jié)熱休克蛋白70的表達(dá)參與大鼠急性缺血性腦卒中過程[6]，然而關(guān)于miR let-7b-3p與急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的關(guān)系未見報(bào)道。因此筆者開展本研究，以期為臨床評估急性缺血性腦卒中患者預(yù)后提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2016年5月至2019年5月平頂山市第二人民醫(yī)院收治的355例急性缺血性腦卒中患者作為研究對象。參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[7]對急性缺血性腦卒中進(jìn)行診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合急性缺血性腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)接受早期溶栓治療；(3)無阿司匹林或氯匹格雷禁忌癥；(4)接受隨訪；(5)首先確診為該病且入組前未接受相關(guān)治療；(6)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有惡性腫瘤；(2)伴有嚴(yán)重主要臟器功能不全者；(3)既往接受顱腦手術(shù)史；(4)凝血功能障礙者；(5)腦出血者；(6)短暫性腦缺血發(fā)作者；(7)合并造血系統(tǒng)疾病或存在出血傾向者。355例急性缺血性腦卒中患者男性209例，女性146例，年齡42～75歲，平均年齡(56.62±7.20)歲，TOAST病因?qū)W分型大動脈粥樣硬化性152例、小動脈閉塞性75例、心源性栓塞70例、病因未明確58例。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集入選病例的性別、年齡、吸煙、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠心病、病灶數(shù)目、急性卒中Or910172治療試驗(yàn)(TOAST)病因?qū)W分型、發(fā)病-治療時(shí)間(onset-to-treatment time,ONT)、出血轉(zhuǎn)化等。采用酶聯(lián)免疫法檢測白介素-10、同型半胱氨酸、D-二聚體水平；利用全自動生化分析儀檢測糖化紅蛋白水平。

1.2.2 血清學(xué)指標(biāo) 抽取入組患者空腹外周靜脈血10 mL，室溫下4000 r/min離心15 min，分離血清與血漿，置于-20 ℃冰箱，待測。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)檢測血漿miR let-7b-3p相對表達(dá)量，Trizol試劑(賽默飛飛世爾)提取的血漿中的總RNA，將2 μg的總RNA添加至20 μL反應(yīng)液中，采用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶(寶生物工程(大連)有限公司)反向轉(zhuǎn)錄合成cDNA；PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min(變性)，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s(退火)，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)(延伸)。miR let-7b-3p正向：5′-CUAUAUAGCCUACUGCCUUCCU-3′，反向：5′-UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-3′；GAPDH正向：5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′，反向：5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt表示miR let-7b-3p相對表達(dá)量。

1.3 隨訪術(shù)后通過電話隨訪或復(fù)診等方式隨訪，記錄患者入院治療后90 d內(nèi)預(yù)后情況。采用改良Rankin量表(modified rankin scale,mRS)評分評估患者預(yù)后情況：患者無功能受限癥狀為0分；患者有功能受限癥狀，但能完成所有工作及日常生活為1分；輕度殘疾，不能完成以前所有活動，但能獨(dú)自處理個(gè)人事務(wù)記為2分；中度殘疾，需他人協(xié)助才能完成日常生活，可獨(dú)立行走為3分；中重度殘疾，他人協(xié)助下可完成日常生活，但不能獨(dú)立行走為4分；重度殘疾，完全失去生活自理能力為5分；死亡為6分。mRS<3分為預(yù)后良好，mRS≥3分為預(yù)后不良。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。服從正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分比[n(%)]表示，采用卡方檢驗(yàn)。用受試者工作特征(ROC)曲線分析miR let-7b-3p、模型A(出血轉(zhuǎn)化、ONT、同型半胱氨酸)、模型B(出血轉(zhuǎn)化、ONT、同型半胱氨酸、miR let-7b-3p)評估急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的價(jià)值。用logistic回歸分析影響急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的相關(guān)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性缺血性腦卒中患者預(yù)后情況355例急性缺血性腦卒中患者出院后3個(gè)月內(nèi)預(yù)后不良發(fā)生率為45.07%(160/355)。死亡15例(4.23%)，重度殘疾36例(10.14%)，中重度殘疾50例(14.08%)，中度殘疾59例(16.62%)。

2.2 兩組基線資料比較根據(jù)患者預(yù)后情況將患者分為預(yù)后不良組(n=160)和預(yù)后良好組(n=195)。兩組在年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、冠心病方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在出血轉(zhuǎn)化、病灶數(shù)目、白介素-10、ONT、TOAST病因?qū)W分型、同型半胱氨酸、糖化紅蛋白、D-二聚體、let-7b-3p方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組基線資料比較

表1續(xù)表

2.3 影響急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的因素將出血轉(zhuǎn)化(否=0，是=1)、病灶數(shù)目(單發(fā)=0，多發(fā)=1)、白介素-10、ONT、TOAST病因?qū)W分型(小動脈粥樣硬化性、心源性栓塞、病因未明確=0，大動脈粥樣硬化性=1)、同型半胱氨酸、糖化紅蛋白、D二聚體、let-7b-3p作為自變量，α入=0.05，α出=0.10，將急性缺血性腦卒中患者預(yù)后情況作為因變量納入logistic回歸分析，結(jié)果顯示出血轉(zhuǎn)化、ONT、同型半胱氨酸及l(fā)et-7b-3p與急性缺血性腦卒中患者預(yù)后密切相關(guān)，見表2。

表2 影響急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的logistic多因素分析

2.4 miR let-7b-3p、模型A及模型B預(yù)測急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的效能利用logistic回歸分析建立出血轉(zhuǎn)化、ONT、同型半胱氨酸預(yù)測急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的模型：F=-7.544+0.494×Hcy+0.015×ONT+0.823×出血轉(zhuǎn)化，將其命名為模型A；出血轉(zhuǎn)化、ONT、同型半胱氨酸、miR let-7b-3p預(yù)測急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的模型：F=-15.886+0.438×Hcy+0.012×ONT+1.323×出血轉(zhuǎn)化+18.512×miR let-7b-3p，將其命名為模型B。miR let-7b-3p預(yù)測急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的AUC高于模型A(Z=2.982，P=0.003)，模型B預(yù)測急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的AUC高于miR let-7b-3p及模型A(Z=2.960，P=0.003；Z=6.082，P<0.001)，見表3。

表3 miR let-7b-3p、模型A及模型B預(yù)測急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的效能

圖1 miR let-7b-3p、模型A及模型B預(yù)測急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

急性缺血性腦卒中是臨床常見的腦血管疾病，近年來其發(fā)病率逐年升高。急性缺血性腦卒中的最佳治療時(shí)間是在發(fā)病后4.5 h之內(nèi)，若未能及時(shí)接受治療則會導(dǎo)致患者偏癱或死亡。及早評估急性缺血性腦卒中患者預(yù)后情況并采取干預(yù)措施對改善患者預(yù)后至關(guān)重要。此前有臨床研究[8]利用血清學(xué)指標(biāo)如中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值等預(yù)測急性缺血性腦卒中患者預(yù)后情況，但其特異度較低，臨床價(jià)值有限，其原因可能與中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值易受外界因素如炎癥性疾病的影響，造成其濃度升高，導(dǎo)致特異性降低。miR let-7b-3p作為微RNA家族一員，可在血漿中穩(wěn)定存在，個(gè)體間差異較小?；A(chǔ)研究[9]證實(shí)，miR let-7b-3p可在急性缺血性腦卒中大鼠血漿中表達(dá)升高，但未探究其與急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的關(guān)系。因此本研究對其進(jìn)行探討。

相關(guān)研究[10]證實(shí)缺血性腦卒中患者let-7b表達(dá)低于健康人群，并且let-7b被證實(shí)在缺血性腦卒中的病理進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，因此認(rèn)為let-7b在與缺血性腦卒中患者的預(yù)后可能存在聯(lián)系。通過對患者進(jìn)行隨訪觀察，了解患者預(yù)后情況，并比較不同預(yù)后患者血漿miR let-7b-3p相對表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良組患者血漿miR let-7b-3p相對表達(dá)量高于預(yù)后良好組，表明血漿miR let-7b-3p可能與患者預(yù)后存在聯(lián)系。先前的研究[11]證實(shí)let-7b可激活toll-like受體(toll-like receptor，TLR)，而該受體為神經(jīng)元細(xì)胞上TLR7的激活劑，可促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，缺血性腦卒中患者預(yù)后不良可能與其該途徑存在聯(lián)系，但尚需進(jìn)一步探究。為進(jìn)一步明確miR let-7b-3p與急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的關(guān)系，本研究采用Logistic回歸分析影響急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的因素，結(jié)果顯示出血轉(zhuǎn)化、ONT、同型半胱氨酸與急性缺血性腦卒中患者預(yù)后密切相關(guān)，結(jié)果與既往研究[12]相符。此外，本研究結(jié)果顯示miR let-7b-3p與急性缺血性腦卒中患者預(yù)后密切相關(guān)。

熱休克蛋白70的異常表達(dá)與急性缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[13]。熱休克蛋白70是一種高度保守的應(yīng)激性蛋白，其基因定位于人1、5、6、9、11及14號染色體上，生理?xiàng)l件下，熱休克蛋白70表達(dá)較低，在受到缺血、缺氧刺激后其表達(dá)增多，并且熱休克蛋白70的核苷酸替換、缺失或插入突變可調(diào)節(jié)啟動子的功能或轉(zhuǎn)錄活性，引起下游基因表達(dá)異常，導(dǎo)致急性缺血性腦卒中的發(fā)生[14]。此外，側(cè)翼區(qū)核苷酸的改變則可影響熱休克蛋白70的表達(dá)和穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)急性缺血性腦卒中的易感性[15]。動物實(shí)驗(yàn)表明，miR let-7b-3p可調(diào)節(jié)熱休克蛋白的表達(dá)。因此，筆者推測miR let-7b-3p可能通過調(diào)節(jié)熱休克蛋白70的表達(dá)參與急性缺血性腦卒中的疾病進(jìn)展。

本研究同時(shí)構(gòu)建了miR let-7b-3p、模型A及模型B預(yù)測急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的ROC曲線，結(jié)果顯示模型B預(yù)測患者預(yù)后的效能高于miR let-7b-3p及模型A，表明增加miR let-7b-3p更有利于預(yù)測急性缺血性腦卒中患者的預(yù)后。

綜上所述，血漿miR let-7b-3p與急性缺血性腦卒中患者預(yù)后關(guān)系密切，檢測血漿miR let-7b-3p表達(dá)情況有助于評估患者預(yù)后。本研究存在一定不足，下一將動態(tài)檢測血漿miR let-7b-3p表達(dá)并進(jìn)行基礎(chǔ)研究，分析miR let-7b-3p影響急性缺血性腦卒中患者預(yù)后的病理生理機(jī)制。