利用生物信息學(xué)方法鑒定與NMIBC相關(guān)的Hub基因

李洪明，吳 凱，歐 銅，吳 松，

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.深圳大學(xué)泌尿外科研究所 深圳大學(xué)第三附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東 深圳 518000)

膀胱癌是臨床上常見的腫瘤，年齡越高其發(fā)病率也越高[1]，男性在發(fā)病率和死亡率方面是女性的數(shù)倍[2-3]。該疾病的主要治療手段是手術(shù)治療[4]，放射治療、化學(xué)治療和免疫治療等在膀胱癌治療中也起到重要作用。相對傳統(tǒng)的治療，生物療法較新穎[5]。靶向療法是眾多生物療法之一，靶向療法重中之重是找到樞紐基因，樞紐基因可能與腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)，可進(jìn)一步影響患者的預(yù)后。WGCNA是一種生物學(xué)研究方法[6]，能在基因模塊與臨床性狀間構(gòu)建關(guān)聯(lián)，確定候選生物標(biāo)記、治療靶標(biāo)和調(diào)控基因等[7-8]。本研究通過WGCNA構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，將網(wǎng)絡(luò)劃分為模塊，篩選與NMIBC相關(guān)的樞紐基因并進(jìn)行一系列生物信息學(xué)分析，期望對臨床有所幫助。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取及處理基因芯片GSE13507數(shù)據(jù)及其臨床信息從GEO數(shù)據(jù)庫下載(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，該數(shù)據(jù)集基于GPL6102(Illumina human-6v 2.0 expression beadchip)平臺。包含165例原發(fā)性膀胱癌樣本，其中NMIBC樣本103例(67例無復(fù)發(fā)歷史，36例有復(fù)發(fā)歷史)，肌層浸潤性膀胱癌樣本62例；復(fù)發(fā)性NMIBC樣本23例；癌旁正常膀胱粘膜樣本58例和正常膀胱粘膜樣本10例。在本研究中，主要研究NMIBC相關(guān)的生物標(biāo)志物，因此刪除數(shù)量較少的10例正常樣本，刪除23例復(fù)發(fā)樣本，刪除62例肌層浸潤性膀胱癌樣本和36例治療后有復(fù)發(fā)史的樣本。將剩余的58例癌旁正常組織樣本與67例NMIBC樣本分為正常組和腫瘤組。篩選表達(dá)量最高的前5000個基因進(jìn)行WGCNA分析。

1.2 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建利用R語言“WGCNA”包構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[9]。利用“cutreeStatic”函數(shù)處理離群值，經(jīng)處理后的矩陣數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。先獲取基因間的相關(guān)系數(shù)，在明確基因一致性表達(dá)后生成鄰接矩陣，后通過鄰接矩陣變換成拓?fù)渲丿B矩陣(topologiacal overlap dissimilarity measure,TOM)，在滿足無尺度網(wǎng)絡(luò)的前提下選擇適當(dāng)?shù)能涢撝郸聵?gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)，按照最小模塊基因數(shù)為30，將相似的基因分類到同一的基因模塊中。

1.3 樞紐模塊篩選引入臨床數(shù)據(jù)，計(jì)算基因顯著性(gene significance,GS)和模塊顯著性(module significance,MS)，根據(jù)MS值篩選樞紐模塊，本研究中選取最顯著的模塊進(jìn)行分析。

1.4 GO和KEGG功能富集分析使用DAVID6.8版本(http://david.abcc.ncifcrc.gov)在線分析工具對樞紐模塊基因進(jìn)行GO生物過程富集分析和KEGG通路富集分析。

1.5 樞紐基因篩選計(jì)算樞紐模塊中模塊基因隸屬度(module membership, MM)，在樞紐模塊中符合|GS|>0.2且|MM|>0.8的基因篩選為備選樞紐基因。利用STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)構(gòu)建樞紐模塊基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)[10]，本研究以點(diǎn)度中心性(degree)≥30為條件篩選另一組備選樞紐基因，對兩備選樞紐基因集合取交集，最后確定樞紐基因。

1.6 樞紐基因驗(yàn)證基于GEPIA[11](http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)在線分析工具對樞紐基因進(jìn)生存分析和結(jié)果驗(yàn)證。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用R語言軟件(3.6.1)調(diào)用Bioconductor處理數(shù)據(jù)，利用WGCNA方法構(gòu)建并劃分網(wǎng)絡(luò)，GEPIA在線分析工具應(yīng)用對數(shù)秩檢驗(yàn)計(jì)算患者的總體生存率，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)篩選GSE13507數(shù)據(jù)共包含256例樣本，經(jīng)篩選最終剩余58例癌旁正常組織樣本與67例NMIBC樣本用于后續(xù)分析。分析流程圖見圖1。

圖1 分析流程圖

2.2 WCGNA分析和模塊計(jì)算共納入125樣本用于構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，其中GSM340606樣本集群高度超過80被標(biāo)識為離群值(圖2A)，刪除離群值后的124個樣本構(gòu)建特征熱圖(圖2B)。為確保無尺度獨(dú)立性(接近0.9)和低均值連通性(接近0)，選取6為軟閾值構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)(圖2C)。以最小模塊基因數(shù)為30的標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建分層聚類樹(圖3A)，相似基因被歸類到同一模塊。共得到14個模塊(圖3B)，通過比較模塊和臨床性狀相關(guān)性系數(shù)的大小，發(fā)現(xiàn)black模塊與腫瘤的關(guān)系最密切(cor=0.72,P=2.6e-82)，用于進(jìn)一步分析(圖3C)。

圖2 樣本樹狀圖和軟閾值估計(jì)

圖3 基因聚類和模塊鑒定

2.3 Hub基因的鑒定在black模塊中，以|GS|>0.2且|MM|>0.8為篩選條件得到67個備選樞紐基因。利用STRING數(shù)據(jù)庫對black模塊基因創(chuàng)建蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)，以degree大于等于30為條件獲得8個備選樞紐基因。利用R語言“VennDiagram包”對兩組備選樞紐基因取交集,最終確定PA2G4和PRPF19為樞紐基因(表1、圖4)。

圖4 樞紐基因韋恩圖

表1 模塊樞紐基因

2.4 功能富集分析對樞紐模塊(black)所包含的508個基因進(jìn)行GO生物過程富集分析及KEGG信號通路富集分析。以P<0.05為篩選條件，顯著富集的GO生物過程有27個條目，表2展示了排名靠前的10個功能；顯著富集的KEGG通路分析有20個，表3展示其中排名靠前的10個結(jié)果。

表2 black模塊基因的GO富集分析結(jié)果

表3 back模塊KEGG富集分析結(jié)果

2.5 樞紐基因驗(yàn)證通過GEPIA對得到樞紐基因進(jìn)于生存分析驗(yàn)證，PA2G4和PRPF192高表者均顯示具有較短的總生存期(P<0.05)(圖5A、5B)；在腫瘤組織和正常組織對比中兩個基因均有表達(dá)差異的現(xiàn)象，在腫瘤組中呈高表達(dá)(圖5C、5D)。

圖5 生存分析及表達(dá)量

3 討論

NMIBC手術(shù)治療有較高的局部復(fù)發(fā)率，約有1/10～1/5的患者治療后進(jìn)展為肌層浸潤性膀胱癌[12]。隨著治療技術(shù)進(jìn)步，精準(zhǔn)治療逐漸成為研究熱點(diǎn)，精準(zhǔn)治療的前提是確定疾病相關(guān)的樞紐基因。本研究通過WGCNA將模塊與臨床特征相關(guān)聯(lián)，篩選出與NMIBC相關(guān)顯著的模塊，進(jìn)一步分析模塊基因鑒定與NMIBC相關(guān)的樞紐基因。

鑒定樞紐基因的方法先前已有部分研究，Deng等[13]運(yùn)用同樣的方法，鑒定8個膀胱癌的樞紐基因；Zhang[14]等鑒定6個與膀胱鱗癌相關(guān)的樞紐基因。Yuan等[15]研究發(fā)現(xiàn)COL3A1過表達(dá)影響膀胱癌預(yù)后。

本研究最終獲得了2個與NMIBC相關(guān)的樞紐基因分別是PA2G4和PRPF19。PA2G4位于12號染色體，參與編碼ErbB3結(jié)合蛋白1(Ebp1) 的亞型(p42和p48)[16]，兩亞型與多種蛋白質(zhì)或RNA相互作用，調(diào)解相應(yīng)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，在人類多種癌組織中有重要作用[17-18]，如在結(jié)直腸腫瘤中能夠促進(jìn)腫瘤其生長[19]。PA2G4作為一種輔助因子，其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，通過競爭性抑制作用可以作為一種潛在的神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療靶點(diǎn)[20]，ErbB3可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化，如參與p53的腫瘤抑制活性[21]。PA2G4P4可促進(jìn)PA2G4的表達(dá)與核易位，對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的活力和凋亡產(chǎn)生影響[22]。PA2G4P4在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著功能作用，通過敲除基因的方法驗(yàn)證了PA2G4P4缺失影響膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和死亡，鑒定其為膀胱腫瘤的標(biāo)記基因[22]。

PRPF19是一種蛋白質(zhì)編碼基因，與泛素-蛋白轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān)，PRPF19泛素連接酶影響底物泛素化水平，在胰腺癌中影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[23]。鄭雨薇[24]等在伯基特淋巴瘤的差異表達(dá)基因中也發(fā)現(xiàn)了PRPF19基因。有研究報(bào)道[25]，PRPF19編碼的蛋白與甲型流感病毒感染細(xì)胞中的NS1蛋白有相互作用，能夠影響病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制，在PRPF19減表達(dá)的情況下，相應(yīng)的病毒復(fù)制受到限制，在膀胱腫瘤中其高表達(dá)是否會影響腫瘤的進(jìn)展有待進(jìn)一步研究。在膠質(zhì)瘤相關(guān)研究中[26]，DNA損傷反應(yīng)基因PRPF19的甲基化使得患者有生存降低。在DNA損傷反應(yīng)中PRPF19能夠發(fā)揮傳感器的作用，激活泛素連接酶驅(qū)動ATR進(jìn)一步影響損傷修復(fù)[27]，許妍妍等[28]發(fā)現(xiàn)，茶多酚影響PRPF19表達(dá)，對微衛(wèi)星不穩(wěn)定性結(jié)直腸癌有抑制作用，也有相關(guān)研究表明PRPF19在卵巢癌的侵襲性中發(fā)揮作用[29]。在胃癌中PRPF19也發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)[30]。以上的研究均發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中存在PRPF19基因高表達(dá)的現(xiàn)象，并且該基因在DNA修復(fù)及泛素相關(guān)調(diào)控中有重要作用，本研究中，通過GEPIA分析發(fā)現(xiàn)其不僅在膀胱腫瘤組織中高表達(dá)，而且高表達(dá)患者的整體生存時間變短，但在膀胱癌中該基因具體發(fā)揮何種作用尚不清楚。

樞紐模塊基因KEGG分析主要富集在HTLV-I感染、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路和醛固酮的合成和分泌等方面。模塊基因GO分析顯示，生物過程主要富集在RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄、蛋白酶體介導(dǎo)的泛素依賴的蛋白質(zhì)分解過程、mRNA剪接體等方面。有研究證實(shí)，mRNA剪接體模式的改變影響對膀胱腫瘤細(xì)胞的抑制作用[31],泛素結(jié)合酶是影響腫瘤微環(huán)境的重要因子，參與DNA修復(fù)和調(diào)控周期分布[32],江偉凡等[33]實(shí)驗(yàn)證明泛素在膀胱癌組織中高表達(dá)，并通過與其他相關(guān)蛋白相互作用促進(jìn)膀胱癌的增值。PRPF19基因也影響泛素-蛋白轉(zhuǎn)移酶活性，進(jìn)一步說明本研究結(jié)果的可靠性。

綜上所述，通過WGCNA的生物學(xué)研究方法鑒定了PA2G4和PRPF19兩個樞紐基因，經(jīng)驗(yàn)證二者表達(dá)與NMIBC患者的預(yù)后相關(guān)，有望成為該疾病的生物標(biāo)志物。