刺五加對酒精戒斷焦慮的作用及機制

趙容杰，王玉花，趙正林，李麗波，李 平，李成沖，劉洪鳳，焦 宇

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1.精神衛(wèi)生學(xué)院；2.醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

改善酒精戒斷焦慮癥被認為治療酒精依賴的重要途徑[1]，但目前常用于治療酒精依賴焦慮癥的苯二氮卓類藥物，因其本身可能具有成癮性，其使用收到很大限制[2]。刺五加為五加科植物刺五加[Acanthopanax senticosus (Rupr.et Maxim.) Harms]的干燥根莖，不僅具有抗衰老、抗炎、提高機體免疫力等作用，還有保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，尤其表現(xiàn)出良好的抗焦慮作用[3]，并無成癮性。

終紋床核(The bed nucleus of the stria terminalis,BNST)是介導(dǎo)酒精戒斷焦慮癥的重要的腦核團[4]。證據(jù)顯示，在應(yīng)激情況下，BNST的去加腎上腺素(Norepinephrine,NE)釋放顯著增多，這是引起煩躁不安和焦慮等情感障礙的重要機制[5]。同時，BNST的NE可刺激釋放促腎上腺激素釋放因子(Corticotropin releasing factor,CRF)引起CRF-ACTH-皮質(zhì)酮(Coritosterone,CORT)應(yīng)激激素反應(yīng)軸的亢奮，也導(dǎo)致焦慮癥[6]。因此，本研究先觀察了刺五加的抗酒精戒斷焦慮癥的作用，后把BNST的NE-CORT通路為靶點探討了作用機制。

1 材料與實驗方法

1.1 實驗動物與主要實驗試劑儀器隨機選取體重在230～250 g之間的40只雄性Sprague-Dawley大鼠，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。實驗動物飼養(yǎng)在恒溫恒濕的獨立通氣系統(tǒng)中，晝夜日光節(jié)律，室溫(24±1) ℃，濕度45%～55%，實驗期間飲食飲水自由。75%酒精(山東安捷高科消毒科技有限公司)，刺五加(根莖粉末，西安金萃坊植物技術(shù)開發(fā)有限公司)，大鼠CORT的ELISA檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，臺式高速低溫離心機(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，曠場實驗箱(上海欣軟信息科技有限公司)，高架十字迷宮(上海欣軟信息科技有限公司)，電子天平(德國賽多利斯公司)，高效液相色譜儀(美國Waters公司)，組織勻漿機(上海季諾科貿(mào)有限公司)。

1.2 實驗分組與模型的建立待動物適應(yīng)環(huán)境7 d后，采用隨機分組的方法將動物分為5組，每組各8只，生理鹽水對照組、酒精戒斷模型組、刺五加低劑量(250 mg/kg)治療組、刺五加高劑量(750 mg/kg)治療組和刺五加高劑量對照組。模型組和兩個刺五加治療組，每天腹腔注射3 g/(kg·次)酒精(20%，vol/vol，在生理鹽水溶解)，2 次/d，共7 d，隨后終止酒精注射3 d，以此制備酒精戒斷焦慮癥模型；對照組注射等容積生理鹽水。在酒精戒斷期，灌胃刺五加治療1 次/d，共3 d；對照組灌胃等容積自來水。第3天灌胃1 h后，各組大鼠分別先后在曠場測試箱和高架十字迷宮里測試其焦慮行為。行為學(xué)檢測結(jié)束后，立即對所有動物施行安樂死，同時收集每只大鼠軀干血液，利用ELISA試劑盒檢測血液中CORT濃度；同時，收集大腦選取BNST，利用高效液相色譜法檢測BNST中NE的含量。

1.3 行為學(xué)測試

1.3.1 曠場實驗 曠場測試箱，長寬高分別為50 cm×50 cm×50 cm，箱體主要由四周及箱底部的黑色有機材料及鋁合金框架組成，箱頂蓋為白色醫(yī)用磨砂有機玻璃(長×寬：50 cm×50 cm)，正中心裝有紅外線攝像裝置，用來觀測并記錄大鼠在自發(fā)活動箱中的運動軌跡及運動時間等指標(biāo)。第3天灌胃結(jié)束1 h后，將大鼠放置于曠場實驗箱的正中央，為避免誤差，放置時均將大鼠頭朝向箱體內(nèi)部同一方向角落，開始記錄5 min內(nèi)大鼠的活動情況。實驗室內(nèi)光線昏暗并保持常亮，溫度控制在(22±1)℃，保持實驗室安靜。每只大鼠檢測后，對實驗箱底部進行清潔處理，以消除氣味對下一只大鼠的影響。觀察指標(biāo)為：大鼠5 min內(nèi)在曠場實驗箱中央?yún)^(qū)域的活動距離(單位：mm)及活動時間(單位：s)。

1.3.2 高架十字迷宮檢測 迷宮整體由兩個相對開放臂(長×寬：10 cm×50 cm)和兩個相對閉合臂(長×寬：10 cm×50 cm)及四臂相交的中央?yún)^(qū)域(長×寬：10 cm×10 cm)構(gòu)成，距離地面高度50 cm。實驗過程中，保持實驗環(huán)境穩(wěn)定并保持安靜。將大鼠置于迷宮中央?yún)^(qū)域，且所有大鼠頭朝向一致，均朝向開臂方向，每只大鼠檢測時間5 min。大鼠檢測后需清潔迷宮，消除對下一只大鼠的影響。觀察指標(biāo)：大鼠進入開放臂進入次數(shù)百分比：進入開放臂次數(shù)/(進入開放臂次數(shù)+進入閉合臂次數(shù))； 在開放臂逗留時間百分比：開放臂時間/(開放臂時間+閉合臂時間)。

1.4 血漿中CORT的含量測定在大鼠行為學(xué)檢測結(jié)束后，利用含有20 μL EDTA (20 mg/mL)的離心管收集大鼠血液(大鼠迅速乙醚麻醉后斷頭，流出的軀干血液)約1 mL，后在4 ℃條件下1500 g離心15 min，隨后收集血漿，利用ELISA試劑盒檢測CORT水平，結(jié)果以ng/mL表示。

1.5 BNST中NE的含量測定行為學(xué)測試完成后，立即處死大鼠，斷頭取大大腦。將腦放置冰盤中央，利用腦模具，根據(jù)George Paxinos和Charles Watson編寫的大鼠腦定位圖譜，精確取出BNST，立即儲存在-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)備用。精密稱取NE標(biāo)準品約5 mg，用2% 高氯酸溶解并定容到5 mL容量瓶作為對照品貯備液(NE濃度：1 mg/mL)。精密吸取貯備液，進行梯度稀釋成最終濃度0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的NE標(biāo)準品梯度樣品，以濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線，并進行線性回歸，得出回歸方程。取出-80 ℃超低溫冰箱凍存的BNST稱重，在樣品中加入4 ℃保存的2%高氯酸處理液0.1 g/mL，放置于冰水混合物中用微型勻漿機充分勻漿。將上述物質(zhì)放入離心機中，以15000 g離心30 min，吸取上清液。取上清液以0.22 μm的微孔濾膜過濾。利用超高效液相色譜進行檢測。色譜條件：色譜柱為Cosmosil-2.6 Cl8(2.1 ID×150 mm)，流動相為甲醇:0.1%甲酸=5:95等度洗脫，流速為0.3 mL/min，室溫20 ℃，波長254 nm，樣品中各主要組分用外標(biāo)法進行定量[7]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準差”表示，并利用GraphPad Prism 6.0軟件進行單因素方差分析和Newman-Keuls組間比較。在方差分析前，對數(shù)據(jù)進行了正態(tài)分布和方差齊性檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 刺五加對大鼠行為學(xué)的影響大鼠在曠場中央?yún)^(qū)的活動距離和時間與其焦慮程度負相關(guān)。

曠場實驗結(jié)果顯示，與生理鹽水對照組相比，酒精戒斷模型組大鼠在曠場中央?yún)^(qū)域活動度明顯降低：刺五加低劑量和高劑量治療分別改善這些大鼠焦慮行為指標(biāo)，但治療效應(yīng)沒表現(xiàn)出劑量依賴性。另外，在刺五加高劑量對照組沒有發(fā)現(xiàn)大鼠的中央?yún)^(qū)活動度發(fā)生改變(P>0.05)，見表1。

表1 刺五加對酒精戒斷大鼠曠場實驗的影響

在高架十字迷宮行為測試中發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水對照組相比，酒精戒斷模型組大鼠的開臂進入次數(shù)和開臂滯留時間均顯著減少，而刺五加低劑量和高劑量治療均能夠顯著提高大鼠在開放臂的探索性,見表2。

表2 刺五加對酒精戒斷大鼠高架十字迷宮實驗的影響

2.2 刺五加對血漿CORT濃度的影響ELISA檢測結(jié)果顯示，與生理鹽水對照組組相比較，酒精戒斷模型組大鼠血漿CORT含量顯著升高(P<0.001)，說明酒精戒斷引起了焦慮；但刺五加低劑量和高劑量治療明顯抑制CORT的濃度升高,見表3。

表3 各組大鼠血漿皮質(zhì)酮檢測結(jié)果

2.3 刺五加對BNST中NE含量的影響

2.3.1 高效液相色譜法標(biāo)準曲線 以濃度為0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的NE標(biāo)準品濃度，繪制標(biāo)準曲線，進行線性回歸分析。如圖1所示，NE標(biāo)準品的線性回歸方程為 y=1874.9x-1723.1(r2=0.995)，NE濃度在0.39～100 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，可用于定量分析BNST中NE的含量。

圖1 NE標(biāo)準品的標(biāo)準曲線

2.3.2 高效液相色譜法檢測BNST中NE的含量 BNST的NE含量被認為與焦慮程度正相關(guān)。高效液相檢測結(jié)果顯示，與生理鹽水對照組相比，酒精戒斷模型組大鼠BNST的NE含量顯著增高(P<0.001)，但刺五加低劑量和高劑量治療明顯抑制此NE的增高。僅給予刺五加沒有引起B(yǎng)NST的NE含量改變,見表4。

表4 刺五加對大鼠終紋床核中NE含量的影響

3 討論

在本實驗研究中，我們觀察到，刺五加低劑量(250 mg/kg)和高劑量(750 mg/kg)治療改善了酒精戒斷大鼠在行為學(xué)測試中的焦慮行為改變，抑制了酒精戒斷焦慮大鼠在血液中的代表應(yīng)激激素CORT的水平升高。同時，在高效液相色譜法檢測中，我們還發(fā)現(xiàn)，刺五加治療降低了酒精戒斷引起的大鼠BNST的NE含量增多。這些結(jié)果表明，在酒精戒斷期給予刺五加治療，可以緩解和阻斷大鼠酒精戒斷焦慮癥，且此作用很可能通過抑制BNST的NE-(CRF-ACTH)-CORT應(yīng)激反應(yīng)軸所介導(dǎo)。

嚙齒類包括大鼠，在酒精戒斷期出現(xiàn)明顯的焦慮癥。這些焦慮癥在曠場和高架十字迷宮行為測試中，在曠場中央?yún)^(qū)大鼠步行距離和停留時間的顯著縮短[8]；在高架十字迷宮測試中表現(xiàn)為大鼠在開放臂的訪問次數(shù)和逗留時間百分比的明顯減少[9]。盡管如此，在酒精戒斷期灌胃低、高劑量刺五加的大鼠，這些焦慮行為被明顯地抑制了。雖然 刺五加的這種抗焦慮效應(yīng)在統(tǒng)計學(xué)上沒有呈現(xiàn)劑量依賴性，但隨著劑量增加其效應(yīng)增強的趨勢比較明顯。已知，大鼠焦慮癥的發(fā)生與血液中應(yīng)激激素水平呈正相關(guān)即，血液中的CORT水平高為焦慮癥的重要生物標(biāo)記[10]。在本研究中，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，在酒精戒斷焦慮癥大鼠血漿中CORT濃度明顯增高，但刺五加兩個劑量治療把酒精大鼠血液中的CORT幾乎恢復(fù)到正常水平。這個ELISA結(jié)果，從激素水平支持了刺五加的抗酒精戒斷焦慮癥的作用，也顯示刺五加對應(yīng)激激素反應(yīng)軸的調(diào)節(jié)是其抗焦慮作用的神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)基礎(chǔ)。

NE-CRF-ACTH-CORT是機體最重要的神經(jīng)內(nèi)分泌應(yīng)激反應(yīng)軸之一。CRF從大腦的含有CRF的神經(jīng)元(又稱CRF能神經(jīng)元)分泌，引起應(yīng)激激素反應(yīng)軸的啟動[11]。神經(jīng)解剖組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在腦內(nèi)CRF能神經(jīng)元主要分布在以下腦區(qū)即，下丘腦、杏仁核、伏隔核、海馬和BNST等[12]。其中，BNST的CRF能神經(jīng)元在焦慮癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。因此，在BNST，CRF與NE一起被稱為“致焦慮因子”。在BNST，NE直接或間接地通過刺激CRF的釋放介導(dǎo)焦慮癥的發(fā)生[13]。本研究中，高效液相色譜法分析發(fā)現(xiàn)，酒精戒斷焦慮癥大鼠BNST的NE水平明顯升高，又一次證明NE的合成和分泌增多是酒精戒斷焦慮癥的神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)基礎(chǔ)。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，刺五加低、高劑量在戒斷期的治療抑制了BNST的NE濃度的升高。這個結(jié)果與行為學(xué)測試和激素檢測結(jié)果一致，表明刺五加通過改善BNST的NE能神經(jīng)傳遞治療大鼠酒精戒斷焦慮癥。

芮施等人報告了刺五加根皮提取物通過改善小鼠腦中五羥色胺和GABA神經(jīng)傳遞提高戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠質(zhì)量的實驗結(jié)果[14]；張倩等研究者發(fā)現(xiàn)，刺五加苷B通過調(diào)節(jié)大腦谷氨酸能神經(jīng)和GABA能神經(jīng)的傳遞改善疲勞小鼠學(xué)習(xí)記憶能力[15]。這些研究間接地支持了本研究的實驗結(jié)果即，刺五加調(diào)節(jié)酒精戒斷所致BNST的NE神經(jīng)傳遞亢進，而治療大鼠酒精戒斷焦慮癥。

綜上所述，本研究觀察和證明了刺五加對酒精戒斷焦慮癥的治療作用，揭示了刺五加通過BNST的NE(-CRF-ACTH-)-CORT通路起到抗焦慮作用的機制。本項目研究為刺五加可能開發(fā)成治療酒精戒斷焦慮癥乃至酒精依賴的治療藥提供了有力的實驗依據(jù)。