PHF19對宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響

劉瑞芳，張志迪，陳夢茜，金在順

(牡丹江醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病理學與病理生理學教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下，病理類型以鱗狀細胞癌最常見[1-2]。鋅指蛋白19(PHD finger protein 19,PHF19)，是多梳抑制復合體2(Polycomb repressive complex2,PRC2)的重要成員之一，定位于人類染色體9q33.2[3]。有研究認為PHF19能夠通過自身Tudor結(jié)構(gòu)域結(jié)合于H3組蛋白36位的賴氨酸殘基，參與染色體活化[4]，并在多種癌癥中發(fā)揮促癌作用。有實驗研究表明了[5]，PHF19在宮頸癌Hela細胞中高表達，siRNA干擾PHF19表達后，Hela細胞增殖抑制并且凋亡增加。因此，本文欲探討PHF19的表達對宮頸癌不同分化程度的細胞(Hela細胞和HCC94細胞)增殖、侵襲和遷移的影響，為尋找宮頸癌臨床潛在治療靶點提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人宮頸癌Hela細胞株購自吉凱公司；人宮頸癌HCC94細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基購自上海立菲生物科技有限公司；胎牛血清購自以色列BI生物科技公司；胰酶購自上海碧云天生物技術有限公司；siRNA試劑盒購自廣州銳博生物有限公司；CCK-8試劑盒購自賽國(中國)生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購自美國OMEGA公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Roche公司；SYBR Green Tap Ready Mix購自美國Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Hela細胞株、HCC94細胞株常規(guī)復蘇，加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗。根據(jù)細胞生長情況，進行換液，傳代，凍存等。

1.2.2 CCK-8檢測細胞增殖能力 取對數(shù)期生長的Hela細胞和HCC94細胞，按每孔2×105個細胞接種于3個96孔板，培養(yǎng)24 h后，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書，按照siRNA-2-50濃度，進行siRNA轉(zhuǎn)染，每組設置3個復孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱孵育4 h，酶標儀測定在450 nm處的吸光值。細胞活力(%)=(siRNA組-空白組)/(對照組-空白組)。

1.2.3 RT-qPCR檢測PHF19的mRNA表達 按照E.Z.N.A.TM HP Total RNA Kit說明書從培養(yǎng)的細胞中提取總RNA，并用NANODROP測定RNA濃度及純度。根據(jù)Roche逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將上述提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)完成擴增，反應條件如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸50 s；進行40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，收集數(shù)據(jù)。每個樣本重復3次，利用2-ΔΔCT法計算各樣本mRNA的相對表達量。引物序列見表1、反應體系見表2。

表1 RT-qPCR引物擴增序列

表2 RT-qPCR反應體系

1.2.4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 培養(yǎng)Hela細胞和HCC94細胞于六孔板中，每孔種3×105個細胞，以未做任何處理組為Hela組和HCC94組、按照轉(zhuǎn)染試劑說明書通過siRNA-2-50(轉(zhuǎn)染試劑說明書中給出的轉(zhuǎn)染濃度)濃度進行轉(zhuǎn)染處理的組為siRNA-2-50組、以siRNA-NC轉(zhuǎn)染處理組為NC組，待各組細胞貼壁后，用10 μL移液器槍頭對每孔內(nèi)劃3條直線，吸凈培養(yǎng)基，PBS輕輕沖洗兩次用倒置顯微鏡拍照，加入siRNA轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)，于12 h、24 h處用倒置顯微鏡拍照。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 培養(yǎng)Hela細胞和HCC94細胞于24孔板，每孔種2×105個細胞，以未做任何處理組為Hela組和HCC94組、按照轉(zhuǎn)染試劑說明書通過siRNA-2-50濃度轉(zhuǎn)染處理組為siRNA-2-50組、以siRNA-NC轉(zhuǎn)染處理組為NC組，胰蛋白酶常規(guī)消化，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞濃度為1×106/mL，Transwell小室鋪Matrigel膠后于培養(yǎng)箱放置1 h，于上室加細胞懸液200 μL，下室加10% FBS 600 μL，培養(yǎng)24 h，第二天PBS沖洗，甲醇固定再沖洗，結(jié)晶紫染色后沖洗，顯微鏡拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析應用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計軟件，計量資料以“均數(shù)±標準差”表示，兩組間差異性比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA作用后Hela細胞和HCC94細胞中PHF19的mRNA表達減少RT-qPCR實驗結(jié)果表明，siRNA作用后與Hela組和HCC94組相比，siRNA-2-50組中PHF19 mRNA的水平表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 siRNA處理后PHF19基因mRNA的相對表達

2.2 siRNA作用后Hela細胞和HCC94細胞增殖活性降低CCK-8檢測結(jié)果說明，siRNA作用24 h、48 h、72 h后，對比Hela組和HCC94組，siRNA-2-50組細胞增殖活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖2)。

圖2 siRNA處理后細胞的存活率

2.3 siRNA作用后Hela細胞和HCC94細胞遷移能力降低細胞劃痕實驗檢測結(jié)果表明，與對照組相比，siRNA作用24 h后，siRNA-2-50組細胞的遷移能力明顯受到抑制，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見圖3)。

圖3 siRNA干擾后細胞的遷移能力

2.4 siRNA作用后Hela細胞和HCC94細胞侵襲能力降低Transwell實驗檢測證實了，siRNA作用24 h后，對比Hela組和HCC94組，siRNA-2-50組細胞的侵襲能力降低，差異有統(tǒng)計學意義(見圖4)。

圖4 siRNA作用后細胞的侵襲能力(×100)

3 討論

多梳蛋白家族(Polycomb group protein,PcG)是一類在染色質(zhì)水平上以表觀遺傳修飾方式調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄因子，通常以PRC的形式存在[6]，在細胞分化、維持細胞特性等多種方面存在至關重要的作用，目前探討較多的是PRC1和PRC2[7]。PHF19是PRC2中的主要成員之一，參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展[8-9]。近年來，許多研究表明PHF19在多種癌癥都發(fā)揮促癌作用，包括皮膚癌、膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌和結(jié)腸癌等。

Tao F等[10]研究證明MALAT1/miR-211/PHF19調(diào)節(jié)軸參與了卵巢癌的發(fā)病，促進了卵巢癌的增殖和遷移。Hu H[4]等有研究表明，PHF19的促進肝癌細胞的遷移、侵襲和增殖。WANG H[11]等研究表明，PHF19在胃癌組織中表達上調(diào)，可促進胃癌細胞的增殖和遷移。由此，我們猜測PHF19作為癌基因也可能在宮頸癌中發(fā)揮促癌作用，本課題組之前已經(jīng)研究證實了[5]PHF19在宮頸癌低分化Hela細胞中高表達，可促進宮頸癌Hela細胞增殖，抑制凋亡，Hela細胞為宮頸癌常用細胞系。因此，我們猜測PHF19是否在宮頸癌高分化細胞(HCC94)中也存在高表達，并且PHF19基因是否可以調(diào)節(jié)宮頸癌的侵襲和遷移能力。

為探究PHF19對宮頸癌細胞的具體影響，我們首先對人宮頸癌不同細胞系(Hela細胞和HCC94細胞)進行siRNA干擾，通過qRT-PCR技術檢測顯示，進行siRNA轉(zhuǎn)染的細胞中PHF19 mRNA的表達量明顯低于對照組細胞，且在統(tǒng)計學上有顯著意義，證明siRNA成功干擾PHF19的表達。我們進行了CCK-8實驗檢測PHF19對宮頸癌Hela細胞和HCC94細胞增殖活力的影響，對siRNA-2-50組、正常對照組、陰性對照組細胞進行24 h、48 h、72 h的培養(yǎng)后，CCK-8結(jié)果均顯示，在siRNA干擾PHF19的表達后，Hela和HCC94細胞的增殖能力均明顯減低。為了觀察PHF19對宮頸癌不同細胞系侵襲、遷移能力的影響，我們分別進行了細胞劃痕實驗、Transwell侵襲實驗。劃痕實驗證實，siRNA處理24 h后，Hela細胞和HCC94細胞的遷移能力明顯受到抑制；Transwell實驗同樣驗證了PHF19可以促進宮頸癌不同細胞系的侵襲能力。

綜上所述，在本研究中PHF19在宮頸癌不同分化程度的細胞系中高表達，但PHF19與宮頸癌不同惡性程度是否存在關系，尚未可知，需要我們進一步實驗證實。通過siRNA干擾PHF19的表達，我們發(fā)現(xiàn)PHF19在宮頸癌中作為促癌基因，促進宮頸癌細胞的增殖及侵襲遷移能力。但是腫瘤的發(fā)生進展是一個較為復雜的過程，受多種細胞因子調(diào)控[12]，其促進宮頸癌發(fā)展進程的具體相關機制尚未得到明確研究。一些研究結(jié)果顯示，PHF19可以影響AKT和ERK的活性，AKT和ERK是兩個信號通路中的兩個關鍵激酶。此外，PHF19基因敲除可能通過降低AKT和ERK信號活性而強烈抑制胃癌細胞的增殖和遷移，提示AKT和ERK信號可能介導PHF19在癌癥中的作用[13]。在此背景下，我們可以猜測PHF19在宮頸癌中是否也可以通過介導對AKT和ERK信號的調(diào)控來影響宮頸癌增殖和侵襲遷移的發(fā)生機制，這值得我們在未來進一步研究闡明。