TUSC3基因表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

劉佳奇，楊 爽,宋 潔，卜曉波

(牡丹江醫(yī)學(xué)院生物教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

TUSC3(tumor suppressor candidate gene 3)，在過去數(shù)年中曾被命名為M33、N33等。該基因位于8號(hào)染色體短臂2區(qū)2帶(8p22)，8號(hào)染色體全長146.364 Mb，包含1198個(gè)基因，是一個(gè)比較典型的高重復(fù)含量和高節(jié)段重復(fù)程度的染色體[1-2]。在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)TUSC3在乳腺癌組織和乳腺癌旁組織中存在差異表達(dá)，并對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖能力產(chǎn)生了影響，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示該基因在乳腺癌中可能發(fā)揮抑癌作用[3]。本研究在此基礎(chǔ)上，通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測了TUSC3表達(dá)水平不同時(shí)的乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力。通過Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測TUSC3表達(dá)水平不同的乳腺癌細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin的表達(dá)，分析結(jié)果的相關(guān)性，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織材料乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231(來自牡丹江醫(yī)學(xué)院病理教研室)；正常乳腺組織蛋白MCF-10A及乳腺癌細(xì)胞株MCF-7(來自哈爾濱醫(yī)科大學(xué))。

1.2 主要試劑TUSC3兔抗人單克隆抗體(寶泰克生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)ABIN3185751)、TUSC3過表達(dá)質(zhì)粒(蘇州吉瑪基因股份有限公司)、TUSC3 siRNA(廣州銳博生物科技有限公司)、Lipo200轉(zhuǎn)染試劑(廣州銳博生物科技有限公司)，Tranwsell試劑盒(寶泰克生物科技有限公司)，Vimentin 、E-cadherin抗體(中國中杉金橋)。

1.3 操作方法

1.3.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞系建立 將處于對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7分別接種在6孔板中。分別通過TUSC3 si-RNA建立TUSC3低表達(dá)細(xì)胞系(MDA-MB-231)及對(duì)照組(TUSC3-siRNA；Scrambled-siRNA)，通過TUSC3過表達(dá)質(zhì)粒建立TUSC3過表達(dá)細(xì)胞系(MCF-7)及對(duì)照組(pcDNA3.1-TUSC3；pcDNA3.1-NC)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3.2 劃痕實(shí)驗(yàn) 用200 μL移液管尖端輕輕刮擦細(xì)胞，然后PBS洗滌。使用光學(xué)顯微鏡在0 h、48 h分別獲得圖像，并記錄劃痕面積(S1、S2)，細(xì)胞遷移率(%)=(S1-S2)/S1×100%，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 Transwell實(shí)驗(yàn) 將配置好的Matrigel膠加入Transwell小室裝置的上室底部，凝固后，將重懸好的細(xì)胞以1×104濃度接種于上室中，在上室和下室分別加入200 μL無血清DMEM和600 μL含有10%胎牛血清的DMEM，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)14～16 h。將下面侵入的細(xì)胞使用甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色20 min。使用光學(xué)顯微鏡取三個(gè)不同視野拍照，計(jì)數(shù)穿至膜下層的細(xì)胞數(shù)，取平均值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUSC3高/低表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響轉(zhuǎn)染后，乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力因TUSC3的表達(dá)不同而發(fā)生變化，見圖1。與對(duì)照組比較，敲除MDA-MB-231細(xì)胞中TUSC3后的細(xì)胞遷移率增高(P<0.0001)，與對(duì)照組比較，使MCF-7細(xì)胞中TUSC3過表達(dá)后，細(xì)胞遷移率下降(P<0.0001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測處理后細(xì)胞遷移能力

2.2 TUSC3高/低表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響與對(duì)照組比較，在MDA-MB-231細(xì)胞中，敲減TUSC3表達(dá)后，穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組，提示細(xì)胞侵襲能力上升(P=0.0055)；與對(duì)照組比較，在MCF-7細(xì)胞中，過表達(dá)TUSC3后，穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于對(duì)照組，提示細(xì)胞侵襲能力下降(P=0.0023)，見圖2。

圖2 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測處理后細(xì)胞侵襲能力

2.3 敲減TUSC3表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲與EMT相關(guān)通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7在分別敲減、過表達(dá)后，E-cadherin和vimentin的表達(dá)。結(jié)果提示，在MDA-MB-231細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，當(dāng)敲減TUSC3表達(dá)時(shí)，E-鈣粘蛋白表達(dá)下降(P<0.05)，波形蛋白上升(P<0.05)，提示與EMT相關(guān)。在MCF-7細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，當(dāng)TUSC3在細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)，E-鈣粘蛋白表達(dá)下降(P>0.05),未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，波形蛋白下降(P<0.05)，見圖3。

圖3 Western blot檢測處理后細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin表達(dá)

3 討論

TUSC3以8號(hào)染色體短臂2區(qū)2帶的短臂缺失，基因異常甲基化等形式在許多癌癥(前列腺癌[4]、胰腺癌[5]、大腸癌[6])的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮不同作用。在之前的研究中我們通過免疫組化和Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TUSC3在乳腺癌組織中表達(dá)低于乳腺癌旁組織。我們選擇了兩個(gè)乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231、MCF-7)根據(jù)該細(xì)胞系中TUSC3的表達(dá)情況，通過使用siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒分別建立了TUSC3高/低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾TUSC3的表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞的增殖能力產(chǎn)生了變化[3]。

乳腺癌高死亡率的主要原因是其發(fā)生了遷移和侵襲。因此，我們通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察干擾TUSC3表達(dá)后細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。結(jié)果顯示，過表達(dá)TUSC3后，乳腺癌細(xì)胞的劃痕閉合率與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對(duì)照組相比更低，穿膜細(xì)胞數(shù)也更少，提示遷移能力和侵襲能力受到了抑制。敲減TUSC3的表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞的劃痕閉合率與小干擾RNA轉(zhuǎn)染的對(duì)照組相比更高，穿膜細(xì)胞數(shù)也更多，提示乳腺癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力上升(P<0.05)，見圖1、圖2。這種負(fù)向調(diào)節(jié)的作用進(jìn)一步說明了TUSC3在乳腺癌中的抑制作用，但它的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多個(gè)步驟的過程，包括上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithel-mesenchymal transition，EMT)、局部侵襲、進(jìn)入血管、通過血管遷移、外滲和在其他組織定植等，而EMT是腫瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的先決條件[7]。研究顯示，腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的主要因素之一是獲得EMT樣表型[3]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，TUSC3在結(jié)直腸癌[6]、卵巢癌[8]中發(fā)揮的作用均與EMT過程相關(guān)。EMT(上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化)是指上皮細(xì)胞通過逐漸喪失其細(xì)胞極性、細(xì)胞間緊密連接和黏附連接，使細(xì)胞增加侵襲力和遷移能力，并產(chǎn)生了大量細(xì)胞外基質(zhì)成分來抑制細(xì)胞凋亡，逐漸變成了具有間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和特性的細(xì)胞[9]。EMT主要的分子特征就是兩個(gè)關(guān)鍵分子表達(dá)的變化，即E-Cadherin下降，Vimentin表達(dá)上升。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲減TUSC3表達(dá)后，E-Cadherin表達(dá)下降，Vimentin上升(P<0.05)，見圖3。符合EMT表型的分子特征。因此，我們認(rèn)為敲減TUSC3表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力增強(qiáng)可能與EMT相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，有幾種信號(hào)途徑與EMT過程相關(guān)：(1)MAPK通路：ERK通路、JNK通路、p38MAPK通路[10]；(2)TGF-β信號(hào)通路[11]；(3)Wnt/beta-catenin通路[12]；(4)NF-κB信號(hào)通路[13-14]；(5)Notch信號(hào)通路[15]；EMT相關(guān)細(xì)胞信號(hào)可以激活多條分子信號(hào)通路，而這些通路上的分子又可以激活EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，互相作用。