黃連根腐病腐霉屬病原菌鑒定

伍曉麗，陳大霞，劉 飛，王 鈺，李隆云

1.重慶市中藥研究院 種植研究所，重慶 400065；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心重慶分中心，重慶 400065；3.重慶市中藥良種選育與評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，重慶 400065；4.中藥資源學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400065；5.重慶市中藥研究院 大健康中心，重慶 400065

黃連為毛茛科黃連屬植物黃連(CoptischinensisFranch.)、三角葉黃連(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云連(CoptisteetaWall.)的干燥根莖．史載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品．性寒，味苦，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)．具有瀉火解毒，清熱燥濕，用于濕熱痞滿、嘔吐吞酸、高熱神昏、心火亢盛、心煩不寐、心悸不寧等[1]．是我國(guó)內(nèi)銷和出口的大宗藥用植物，也是全國(guó)100多種中成藥的原料，主產(chǎn)于四川、湖北、重慶等地．近10年來(lái)，根腐病在各大產(chǎn)區(qū)爆發(fā)，使連農(nóng)遭受重大損失，種連積極性大大降低，嚴(yán)重制約著黃連產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；l(fā)展．此外，黃連連作會(huì)加劇根腐病的發(fā)生[2-3]．該病目前還沒(méi)有有效的防治方法．

項(xiàng)目組和其他研究人員前期研究的結(jié)果表明，真菌是黃連根腐病的致病病原之一，其中鐮刀菌是強(qiáng)致病菌[4-5]．同時(shí)，病根中腐霉屬真菌分離頻率也很高，高于鐮刀菌[6]，推測(cè)其中可能也包含致病菌，因此本研究對(duì)其中的腐霉屬真菌進(jìn)行了致病性研究．

1 材料與方法

1.1 材 料

材料和取材方法見(jiàn)已發(fā)表文獻(xiàn)[6]．

1.2 試劑與儀器

B518259Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，生工SangonBiontech；RR178 Fungi Identification PCR Kit，Takara；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋；脫皮麥粒-木屑培養(yǎng)基：木屑和脫皮麥粒清水浸泡24 h，瀝干水分，按照木屑與脫皮麥粒比例為3∶1混合均勻，裝平皿，121 ℃滅菌40 min．

超微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000)，Thermo Scientific公司；水平電泳儀(DYY-6C)，北京六一生物科技有限公司；PCR儀(PTC-100)，Bio-Rad公司；凝膠成像儀(Gel Doc XR)，Bio-Rad公司；電子顯微鏡(OlympusCX31-32C02)，奧林巴斯株式會(huì)社．

1.3 方 法

1.3.1 腐霉屬菌株分離與純化

組織分離的方法見(jiàn)已發(fā)表的文獻(xiàn)[6]，25 ℃培養(yǎng)5～7 d后，挑取組織周圍長(zhǎng)出的似腐霉屬的菌絲(菌絲白色，短，稀疏，貼培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，菌落呈菊花瓣型、月季花瓣型、放射型或平滑型[7-8])，轉(zhuǎn)接入PDA中進(jìn)行純化，直到獲得純菌落．

1.3.2 可培養(yǎng)真菌分子鑒定

分子鑒定的方法見(jiàn)已發(fā)表的文獻(xiàn)[6]．

1.3.3 離體回接

選取腐霉菌株，在PDA培養(yǎng)基上，黑暗條件下，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，至菌絲長(zhǎng)滿平皿．剪取健康黃連根條(約3～4 cm)，無(wú)菌水清洗5次，無(wú)菌濾紙吸干多余水分，置于平皿中菌絲上，12條根/平皿，分別置于25 ℃和室溫(4.3～14.2 ℃)，在黑暗條件下共培養(yǎng)7～10 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況．以25 ℃下水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的健康黃連根條為對(duì)照．

1.3.4 活體回接

取離體回接篩選出的發(fā)病嚴(yán)重的菌株，接種于脫皮麥粒-木屑培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)10～15 d，至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，備用；健康2年生黃連苗，將根部泥土雜物洗凈，無(wú)菌水清洗5次，剪斷部分須根制造傷口，備用；河沙混合腐殖土(2∶1)作為基質(zhì)，120 ℃高溫烘烤滅菌3 h，冷卻，加無(wú)菌水潤(rùn)濕，備用；小花缽用5 ‰高錳酸鉀溶液浸泡24 h消毒后用無(wú)菌水洗凈，先加入厚約2 cm的滅菌基質(zhì)墊底，再填入2 g長(zhǎng)滿腐霉菌絲的脫皮麥粒-木屑培養(yǎng)基，栽入黃連苗，把基質(zhì)和脫皮麥粒-木屑菌種混合均勻后填入花缽蓋住根，澆透無(wú)菌水，置于25 ℃培養(yǎng)箱，光照8 h /d．部分苗置于室溫生長(zhǎng)(日均溫4.7～11.2 ℃)．12株苗/處理．對(duì)照苗不接種菌，其余培養(yǎng)方法同上．7 d后開(kāi)始觀察，15 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)(DI)．并取發(fā)病根條，按照步驟1.3.1的操作進(jìn)行病原菌再分離．

DI=∑(PA×LE)×100/(TO×HI)

式中，PA為各級(jí)病株數(shù)，LE為級(jí)數(shù)，TO為調(diào)查總數(shù)，HI為最高級(jí)數(shù)．

1.3.5 致病菌系統(tǒng)發(fā)育分析

以致病菌株ITS序列為基礎(chǔ)，用BioEdit和MEGA6.0 軟件按照鄰接法，自展數(shù)為1 000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)．

1.3.6 病原菌形態(tài)觀察

取致病菌株，在PDA培養(yǎng)基上采用“插片法”，25 ℃黑暗培養(yǎng)10～15 d后，進(jìn)行顯微形態(tài)觀察．

1.3.7 腐霉培養(yǎng)基篩選

由于腐霉在PDA上長(zhǎng)期保存會(huì)很快枯萎死亡，不容易繼代．因此對(duì)其保存培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選．基質(zhì)原料：帶皮小麥(浸泡48 h過(guò)心，瀝干水分)、脫皮小麥(浸泡48 h過(guò)心，瀝干水分)、木屑(浸泡24 h，擠干水分)、玉米油，以上原料按照不同比例進(jìn)行混合后，裝平皿，121 ℃滅菌40 min，接種腐霉菌種，25 ℃培養(yǎng)15～20 d后，觀察菌絲生長(zhǎng)狀況，篩選最優(yōu)良的培養(yǎng)基．

2 結(jié)果與分析

2.1 離體回接發(fā)病情況

共計(jì)分離到8個(gè)不同的腐霉屬菌株．由于其他菌株污染，取未污染的菌株Q進(jìn)行離體回接．結(jié)果表明，無(wú)論是高溫還是低溫下，它的致病性都比較強(qiáng)，大約5 d 后開(kāi)始發(fā)病，10 d時(shí)根條全部腐爛變黑．因此挑取Q進(jìn)行進(jìn)一步的活體回接試驗(yàn)(表1，圖1)．

表1 黃連根條離體回接發(fā)病情況

圖1 離體回接發(fā)病情況

2.2 活體回接發(fā)病情況

Q菌株在室溫和25 ℃下均會(huì)發(fā)病，發(fā)病程度高溫比低溫略高，差別不明顯．病株全部根或大量根變黑，葉片枯萎，新葉較對(duì)照數(shù)量少，長(zhǎng)勢(shì)弱．活體回接發(fā)病的根條進(jìn)行再分離，仍然能分離到形態(tài)相同的菌株(表2，圖2)．

圖2 活體回接發(fā)病情況

表2 活體回接發(fā)病情況

2.3 致病菌株顯微形態(tài)

Q菌株的菌落在PDA上呈玫瑰花瓣形，菌絲短，米白色，貼培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，較稀疏．菌絲直徑3.1～6.7 μm左右．孢子囊有絲狀、球形或橢球形兩種，后者直徑17.7～20.4 μm．游動(dòng)孢子直徑3.8～6.6 μm，部分發(fā)現(xiàn)芽管萌發(fā)[7](圖3)．

圖3 菌株Q顯微形態(tài)

2.4 最適合培養(yǎng)基篩選

培養(yǎng)基篩選接種的菌種是Q，它在純帶皮麥粒和純木屑上幾乎無(wú)菌絲生長(zhǎng)，而純脫皮麥粒上生長(zhǎng)最旺盛，可作為腐霉生長(zhǎng)和保存的培養(yǎng)基．添加玉米油對(duì)菌絲生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用(表3)．

表3 不同培養(yǎng)基上腐霉菌絲生長(zhǎng)狀況

2.5 腐霉屬菌株分子鑒定結(jié)果及致病菌系統(tǒng)發(fā)育分析

8個(gè)腐霉屬菌株的分子鑒定結(jié)果見(jiàn)表4．

表4 黃連病根中腐霉屬菌株分子鑒定結(jié)果

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，1B，1F，3B，13.20和P.intermedium聚為一枝，I2，2.2，3J和P.spinosum聚為一枝．Q和P.macrosporumstrain CBS 574.80聚為一枝(圖4)．

圖4 黃連根條中腐霉屬菌株基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié) 論

腐霉(Pythium)是藻物界，卵菌門，卵菌綱，霜霉目，腐霉科的一個(gè)屬[8]．該屬真菌分布十分廣泛，且可腐生、寄生或兼性寄生，又可水生、陸生或水陸兩棲生．許多種類是重要的土傳植物病原菌，常造成果實(shí)腐爛、根腐、莖基腐和幼苗猝倒病等．迄今為止，重要的植物病原腐霉已經(jīng)超過(guò)80種，對(duì)農(nóng)作物危害很大[9]．

腐霉屬菌在黃連根腐病根條中分離頻率很高，且包含多個(gè)種[6]．這些種很多都是其他植物的根腐病菌．P.spinosum可導(dǎo)致小麥根腐病[10]，P.sylvaticum可導(dǎo)致大豆、大蒜根腐病[11-12]．P.intermedium可導(dǎo)致歐防風(fēng)(PastinacasativaL.)[13]、狗薔薇(RosacaninaL.)[14]幼苗根腐?。甈.macrosporum可導(dǎo)致花卉鱗莖腐爛和草類[15]、胡蘿卜[16]的根腐病．Q和P.macrosporumstrain CBS 574.80聚類可信度是100，P.macrosporumstrain CBS 574.80是模式菌株，A.J.van der用這株菌對(duì)P.macrosporum這個(gè)種進(jìn)行描述和定義[7]，結(jié)合顯微特征，說(shuō)明Q就是P.macrosporum．因此P.macrosporum是黃連根腐病致病菌之一．本研究還發(fā)現(xiàn)該菌在低溫下也對(duì)黃連根條具有致病性，且致病能力和25 ℃時(shí)沒(méi)有明顯差別．其他腐霉也有類似報(bào)道，如Pythiumsulcatum在10 ℃，18 ℃和24 ℃均能導(dǎo)致歐芹幼苗[13]和狗薔薇幼苗根腐病[14]．國(guó)內(nèi)外有關(guān)P.macrosporum的報(bào)道很少，該菌在荷蘭[7，15]、德國(guó)[7]、加拿大[7，16]和美國(guó)[17]均有分離到，在國(guó)內(nèi)是首次分離報(bào)道．根據(jù)以上分析推測(cè)，其他7株未作回接的腐霉菌株中可能也包含在不同溫度侵染黃連根部的致病菌，有待進(jìn)一步研究．

腐霉離體回接發(fā)病表現(xiàn)和鐮刀菌不同，前者只是腐爛變黑，而后者會(huì)產(chǎn)生大量黃色水珠，且腐爛程度比腐霉高[5]．說(shuō)明腐霉致病能力不如鐮刀菌強(qiáng)．而即便如此，腐霉具有鐮刀菌不具備的低溫致病能力[5]，與高溫致病的鐮刀菌配合，延長(zhǎng)了侵染時(shí)期，大大增加了黃連根腐病的防治難度．

腐霉菌絲在純帶皮小麥上幾乎不生長(zhǎng)，加了濕潤(rùn)的木屑才生長(zhǎng)，在脫皮小麥上生長(zhǎng)最好，推測(cè)原因是純帶皮小麥表面水分容易干，木屑和脫皮小麥能保持濕潤(rùn)．但腐霉在純木屑上不生長(zhǎng)，說(shuō)明它對(duì)木質(zhì)纖維分解能力弱，需要淀粉作為外源養(yǎng)分．很多腐霉的培養(yǎng)基都含有油脂類成分，常用的KPYG2培養(yǎng)基就含有玉米油[18-19]．因此，本研究在基質(zhì)中添加玉米油，結(jié)果對(duì)菌絲生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用．推測(cè)玉米油和純脫皮小麥的組合培養(yǎng)效果更佳，擬進(jìn)行進(jìn)一步的比較研究．