呼倫貝爾地區(qū)MRSA耐藥譜及分子流行病學(xué)特征分析

孫 剛，孫 輝，杜彥丹，李寅雁，李英智，董占柱，佟力軍，彭 博

（1.內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院 內(nèi)蒙古民族大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 牙克石 022150；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 通遼 028000 ）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistantStaphylococcus aureus，MRSA）是引起醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的主要病原菌，可以引起各種致死性感染，如心內(nèi)膜炎、敗血癥和肺炎等。本研究對呼倫貝爾地區(qū)MRSA的耐藥譜及分子流行病學(xué)特征進(jìn)行分析，以期為臨床防控和治療金黃色葡萄球菌感染提供幫助。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2012年1月—2017年6月內(nèi)蒙古呼倫貝爾地區(qū)5家醫(yī)院（內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院、牙克石市人民醫(yī)院、呼倫貝爾市人民醫(yī)院、滿洲里市人民醫(yī)院、扎蘭屯市人民醫(yī)院）MRSA非重復(fù)臨床分離株55株，其中分離自痰樣本28株、分離自咽拭子樣本和膿液樣本各8株、分離自傷口分泌物樣本7株、分離自中段尿樣本4株。質(zhì)控菌株腐生葡萄球菌（BAA-750）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）購自我國國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心，葡萄球菌染色體mec基因盒（staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）基因分型標(biāo)準(zhǔn)陽性對照菌株NCTC 10042（SCCmecⅠ型）、N315（SCCmecⅡ型）、85/2080（SCCmecⅢ型）、JCSC4744（SCCmecⅣ型）、HS663（SCCmecⅤ型）由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈。

1.2 主要儀器與試劑

Vitek 2 Compact自動化鑒定藥敏系統(tǒng)及配套革蘭陽性菌鑒定卡GP、革蘭陽性菌藥敏卡GP-67（法國生物梅里埃公司），Veriti型PCR儀（美國ABI公司），EPS600型瓊脂糖凝膠電泳儀、4200 SF型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）。頭孢西丁藥敏紙片（英國Oxoid公司），金黃色葡萄球菌乳膠凝集試劑（廣東環(huán)凱微生物科技公司），溶葡萄球菌素、引物、DNA ladder Marker、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑（北京梓熙生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定和MRSA篩查 所有金黃色葡萄球菌臨床分離株均采用乳膠凝集試劑和Vitek 2 Compact自動化鑒定藥敏系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)核，并采用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法篩查MRSA。采用PCR檢測所有金黃色葡萄球菌的mecA基因與femB基因，若mecA與femB基因皆為陽性，則判斷為MRSA[1]。

1.3.2 體外藥物敏感性試驗(yàn) 采用Vitek 2 Compact自動化鑒定藥敏系統(tǒng)分析金黃色葡萄球菌對12種抗菌藥物（紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、慶大霉素、利福平、利奈唑胺、萬古霉素、替加環(huán)素）的耐藥性，根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2017年版標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

1.3.3 總DNA提取 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取菌株DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 SCCmec基因分型檢測 采用多重PCR進(jìn)行SCCmec基因分型，參照文獻(xiàn)[2]設(shè)計引物、擴(kuò)增條件、反應(yīng)條件。與標(biāo)準(zhǔn)菌株出現(xiàn)相同產(chǎn)物長度的條帶為該SCCmec型別，SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及V型分別出現(xiàn)695、937、1791、1 287及518 bp。

1.3.5 多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST） 采用PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌染色體DNA上7個管家基因（arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi及yqiL）的可變區(qū)片段，根據(jù)文獻(xiàn)[3]設(shè)計引物、 擴(kuò)增條件、反應(yīng)條件，PCR產(chǎn)物送北京梓熙生物科技有限公司進(jìn)行純化和測序，測序采用雙向測通方法。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Whonet 5.6 軟件進(jìn)行細(xì)菌耐藥性分析。MLST結(jié)果用 eBURST 軟件進(jìn)行分析，人工校對后將7個管家基因序列通過MLST數(shù)據(jù)庫（http：//www.mlst.net）進(jìn)行比對，獲得每個管家基因的等位號碼，綜合所有等位號碼來確定序列型別。獲得ST型別后用eBURST軟件進(jìn)行克隆型聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 SCCmec基因分型結(jié)果

55株MRSA中，SCCmecⅡ型3 2株（58.18%）、SCCmecⅤ型14株（25.45%）、SCCmecⅢ型6株（10.91%）、SCCmecⅠ型1株（1.82%）、無明確型別2株。SCCmec基因多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖1。

圖1 部分MRSA SCCmec多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 MLST基因分型結(jié)果

55株MRSA中，共檢出10個基因型，ST59為優(yōu)勢型別（28株），以下依次為ST239和ST72（各6株）、 ST630（5株）、ST398（4株）、ST25（2株）、ST5和ST15（各1株），另發(fā)現(xiàn)2個可能新型別（已提交給分子分型和微生物基因組多樣性公共數(shù)據(jù)庫，尚未得到反饋）。

2.3 MLST聯(lián)合SCCmec基因分型結(jié)果

55株MRSA中，ST59-MRSA-SCCmecⅡ型為優(yōu)勢型別，共檢出22株（38.18%）；其次為T59-MRSA-SCCmecⅤ型和ST72-MRSASCCmecⅡ型，各檢出6株（10.91%），檢出率居第3位的是ST239-MRSA-SCCmecⅢ型，檢出4株（7.27%）。見表1。

表1 MLST聯(lián)合SCCmec基因分型結(jié)果

2.4 體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

55株MRSA對利奈唑胺、萬古霉素和替加環(huán)素均敏感，對紅霉素和克林霉素的耐藥率分別為81.82%、78.18%，見表2。ST59型和ST239型對喹諾酮類、慶大霉素、利福平耐藥率差異較大，ST59型MRSA對環(huán)丙沙星、慶大霉素的耐藥率均僅為3.57%，未檢出左氧氟沙星、莫西沙星、利福平耐藥菌株；而ST239型MRSA對上述抗菌藥物的耐藥率均為83.33%；ST72型MRSA除對紅霉素、克林霉素高水平耐藥外，未檢出對其他抗菌藥物耐藥菌株；ST239型MRSA對紅霉素和克林霉素的耐藥率（66.67%）低于ST59型（85.71%）和ST72型（83.33%）；見表3。

表2 MRSA對12種常用抗菌藥物的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 株（%）

表3 主要MLST型別MRSA對12種抗菌藥物的耐藥率 %

3 討論

本研究對內(nèi)蒙古呼倫貝爾地區(qū)55株MRSA進(jìn)行SCCmec、MLST基因分型和抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，旨在了解本地區(qū)MRSA的耐藥譜和分子流行病學(xué)特征。

SCCmec基因盒現(xiàn)分為11個型別，其中Ⅱ和Ⅲ型是醫(yī)院感染MRSA的常見類型，含有甲氧西林耐藥基因（mecA基因）和其他抗菌藥物耐藥基因[4]。本研究結(jié)果顯示，55株MRSA以SCCmecⅡ型為主（58.18%），SCCmecⅤ型占25.45%，SCCmecⅢ型占10.91%，SCCmecⅠ型占1.82%，無明確型別占3.64%。這與我國大部分地區(qū)以SCCmecⅢ型為主的情況不一致，與延邊地區(qū)（65.0%）、大連（56.7%）、沈陽（50.0%）[5-6]以SCCmecⅡ型為主相似，可能和這3個地區(qū)與內(nèi)蒙古呼倫貝爾地區(qū)毗鄰有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，ST59-MRSA-SCCmecⅡ型M R S A為呼倫貝爾地區(qū)的主要流行株（38.18%）。MLST共檢測出10個基因型，ST59為優(yōu)勢型別（50.91%），可能為呼倫貝爾地區(qū)的流行克隆株，這與相關(guān)文獻(xiàn)報道的ST239-MRSA為最流行基因型[7-9]不一致。有研究結(jié)果表明，2016年我國MRSA最流行基因型已經(jīng)發(fā)生改變，ST239-MRSA的檢出率由2013年的42.4%降至2016年的11.6%（P＜0.001），ST59型和ST5型已經(jīng)成為最常見的基因型[10]，與本研究結(jié)果一致。

本研究55株MRSA的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果與CHINET的統(tǒng)計結(jié)果相比，除對克林霉素的耐藥率（78.18%）略高于全國水平（66.7%）外，對其他的抗菌藥物的耐藥率均低于全國水平，尤其是對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星這2種喹諾酮類藥物[11]。比較耐藥譜間的差異后發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)的流行株ST59對環(huán)丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平的敏感率較高，體現(xiàn)出MRSA耐藥譜的地域特異性。

目前，MRSA的高耐藥率仍是臨床面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。本研究分析了呼倫貝爾地區(qū)MRSA的分子流行病學(xué)特征，有助于為本地區(qū)MRSA的臨床治療、感染控制以及暴發(fā)流行監(jiān)測提供科學(xué)的參考。