GPⅠa基因G873A、C807T位點(diǎn)在心腦血管疾病和糖尿病患者中的多態(tài)性分布

焦瑞寶，唐吉斌，周佳麗，朱娟娟，陳繼中

（皖南醫(yī)學(xué)院附屬銅陵市人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，安徽 銅陵 244000）

心腦血管疾病具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，腦血管疾病已經(jīng)超越心血管疾病、惡性腫瘤，成為我國居民首位致死原因，在我國，腦卒中的發(fā)病率為1 114.8/10萬，其中缺血性腦卒中（又稱腦梗死）占69.6%[1]。目前，由于不良生活習(xí)慣（抽煙、酗酒、低運(yùn)動(dòng)量、高糖和高脂飲食）的廣泛存在，我國心腦血管疾病高發(fā)狀況仍沒有緩解的跡象，并有低齡化的趨勢。血小板異常聚集可導(dǎo)致動(dòng)脈血栓形成，而血栓形成是心腦血管疾病的主要病理生理學(xué)誘因。阿司匹林具有最充分的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)、最佳的經(jīng)濟(jì)效益比、最廣泛的適應(yīng)癥，被世界各國醫(yī)學(xué)指南一致推薦為抗血小板治療的一線藥物，在我國已被廣泛應(yīng)用于血栓性疾病、心血管疾病的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防。但是，相關(guān)臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，有5%～45%的患者對(duì)阿司匹林治療不敏感，即存在阿司匹林抵抗（aspirin resistance，AR）[2]。目前，AR的確切機(jī)制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，部分基因位點(diǎn)多態(tài)性與AR有關(guān)[3]。2019年底，我國糖尿病患者已經(jīng)達(dá)到1.16億例，長期、反復(fù)高血糖很容易誘發(fā)心腦血管疾病，甚至出現(xiàn)糖尿病性腦猝死或腦血管意外。本研究擬探討阿司匹林藥效相關(guān)血小板膜糖蛋白GPⅠa基因G873A、C807T位點(diǎn)在心腦血管疾病和糖尿病患者中的多態(tài)性分布，為臨床抗血小板個(gè)體化治療提供遺傳學(xué)指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年9月—2020年10月銅陵市人民醫(yī)院行阿司匹林藥效相關(guān)血小板膜糖蛋白GPⅠa基因G873A和C807T位點(diǎn)檢測的住院患者811例，其中心血管疾病患者106例（心血管疾病組），男71例、女35例，年齡（71.65±11.03）歲，包括冠心病、心肌梗死、高血壓病、心功能不全等；腦血管疾病患者597例（腦血管疾病組），男359例、女238例，年齡（63.12±12.03）歲，包括腦梗死、腦卒中、椎基底動(dòng)脈綜合征、短暫性腦缺血發(fā)作等；糖尿病患者108例（糖尿病組），男70例、女38例，年齡（64.12±10.43）歲，包括2型糖尿病、2型糖尿病性周圍神經(jīng)病等。

1.2 主要儀器和試劑

ETC811基因擴(kuò)增儀（蘇州東勝公司），PyroMark Q24 MDx實(shí)時(shí)定量焦磷酸序列分析儀、MX-M型混勻儀（德國凱捷公司），D3024型高速離心機(jī)、MX-S型漩渦震蕩器（美國賽洛捷克公司），脫氧核糖核苷三磷酸（日本TakaRa公司），DNA提取試劑盒、測序反應(yīng)通用試劑盒（長沙三濟(jì)公司）。

1.3 方法

采集所有研究對(duì)象靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鈉抗凝，采用硅膠柱提取、純化基因組DNA。將提取的DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性25 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。采用PyroMark Q24 MDx實(shí)時(shí)定量焦磷酸序列分析儀測定擴(kuò)增產(chǎn)物GPⅠa基因G873A、C807T位點(diǎn)的基因多態(tài)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素ANOVA方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)；計(jì)量資料以例（率）表示，組間基因型及等位基因分布狀況比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3個(gè)組一般特征比較

3個(gè)組之間性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；心血管疾病組、腦血管疾病組、糖尿病組年齡依次升高（P＜0.05）。見表1。

表1 3個(gè)組一般特征比較

2.2 3個(gè)組GPⅠa基因G873A、C807T位點(diǎn)分布

GPⅠa基因G873A、C807T位點(diǎn)的野生型、雜合突變型和純合突變型均同步出現(xiàn)，3個(gè)基因型在3個(gè)組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。糖尿病組純合突變型高于心血管疾病組和腦血管疾病組（P＜0.01），雜合突變型低于心血管疾病組和腦血管疾病組（P＜0.01）。心血管疾病組、腦血管疾病組和糖尿組之間等位基因A、T分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。GPⅠa基因G873A、C807T雜合突變型和純合突變型合計(jì)為47.17%～53.27%，等位基因A和T均為24.53%～31.48%。見表2。

表2 3個(gè)組GPⅠa基因G873A、C807T位點(diǎn)基因多態(tài)性分布 例（%）

2.3 3個(gè)組不同性別患者GPⅠa基因G873A、C807T基因型及等位基因分布

心血管疾病組男性與女性之間GPⅠa基因G873A、C807T位點(diǎn)基因型和等位基因分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.734、P=0.737）；腦血管疾病組男性與女性基因型和等位基因分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.927、P=0.749）；糖尿病組男性與女性基因型和等位基因分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.138、P=0.283）。見表3、表4和表5。

表3 不同性別心血管疾病患者基因型和等位基因分布比較 例（%）

表4 不同性別腦血管疾病患者基因型和等位基因分布比較 例（%）

2.4 3個(gè)組不同年齡患者基因型、等位基因分布比較

按照年齡將811例患者分為29～60歲組（228例）、61～70歲組（197例）、71～80歲組（273例）、81～94歲組（113例）4個(gè)年齡亞組，4個(gè)年齡組患者基因型、等位基因分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.530、P=0.941）。見表6。

表6 3個(gè)組不同年齡患者基因型和等位基因分布比較 例（%）

3 討論

血栓形成是心腦血管疾病的主要病理生理學(xué)基礎(chǔ)，當(dāng)血管內(nèi)皮受損時(shí)，機(jī)體通常會(huì)啟動(dòng)血小板激活和聚集機(jī)制。首先，血小板內(nèi)皮膠原蛋白被激活，血液流速變慢，血小板表面的GPⅠa與血管性血友病因子（vascular von Willebrand factor，VWF）結(jié)合，血小板上的膠原蛋白受體活化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，促進(jìn)血小板的變形和脫顆粒，而后血小板釋放花生四烯酸（arachidonic acid，AA），環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）-1催化AA使其形成血栓素A2（thromboxane，TXA2）。阿司匹林可直接且不可逆地抑制COX-1和COX-2，抑制血小板合成TXA2[4]，TXA2具有強(qiáng)大的促血小板聚集作用，其生成減少最終會(huì)導(dǎo)致血小板聚集功能受到抑制。同時(shí)，阿司匹林還可以抑制低濃度膠原、凝血酶、抗原抗體復(fù)合物等引起的血小板聚集和釋放反應(yīng)及自發(fā)性凝集，發(fā)揮預(yù)防血栓形成的作用[5]。

阿司匹林是具有高危因素抗血小板指征心腦血管疾病患者長期使用的一級(jí)預(yù)防用藥。5%～45%的患者對(duì)阿司匹林治療呈非敏感反應(yīng)，即存在AR。AR可以從以下2個(gè)方面定義：（1）臨床抵抗，即患者在規(guī)律服用治療劑量的阿司匹林后出現(xiàn)新的血管事件；（2）實(shí)驗(yàn)室抵抗，即通過實(shí)驗(yàn)室測定發(fā)現(xiàn)阿司匹林并未有效抑制血小板聚集[6]。目前，臨床應(yīng)用最為廣泛的是用10 μmol/L的二磷酸腺苷作為誘導(dǎo)劑，其平均血小板聚集率≥70%；或者用0.5 mg/mL AA作為誘導(dǎo)劑，其平均血小板聚集率≥20%[7]。引起AR的常見因素有藥物依從性差、藥物吸收和代謝、藥物間相關(guān)作用、血小板聚集通路激活、環(huán)境或生活方式、藥物治療人群的選擇和基因多態(tài)性等，其中基因多態(tài)性被臨床及科研工作者廣泛關(guān)注[8]。孫洲亮等[9]分析了35例AR患者基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)GPⅠa基因C807T雜合突變型（32例，91.43%）、G873A雜合突變型（31例，88.57%）明顯高于對(duì)應(yīng)的野生型。王林等[7]也發(fā)現(xiàn)GPⅠa基因C807T在阿司匹林抵抗組、半抵抗組的T等位基因頻率高于阿司匹林敏感組。

本研究中，糖尿病組阿司匹林藥效相關(guān)GPⅠa基因G873A和 C807T位點(diǎn)的純合突變型高于心血管疾病組和腦血管疾病組（P＜0.01），雜合突變型低于心血管疾病組和腦血管疾病組（P＜0.01）；3個(gè)組基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但等位基因分布差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。有研究結(jié)果顯示，糖尿病患者長期、反復(fù)高血糖會(huì)引起小血管和毛細(xì)血管損傷，伴發(fā)高血脂等可引起大血管動(dòng)脈粥樣硬化性改變、血管內(nèi)膜及內(nèi)膜下受損動(dòng)脈壁病變[10]，我國有75%的糖尿病患者最終死于心、腦血管疾病[11]，提示對(duì)糖尿病患者和心、腦血管疾病患者發(fā)生AR概率更大，及早進(jìn)行抗血小板治療非常重要。

本研究中，患者年齡比較，心血管疾病組＞腦血管疾病組＞糖尿病組，可能是由3種疾病自身發(fā)病機(jī)制所決定的。進(jìn)一步按照性別對(duì)3個(gè)組進(jìn)行組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，3個(gè)組組內(nèi)男性、女性患者基因型和等位基因分布差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同年齡患者基因型多態(tài)性分布和等位基因分布比較，差異也均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

本研究還發(fā)現(xiàn)，GPⅠa基因G873A和C807T位點(diǎn)野生型、雜合突變型和純合突變型均同步出現(xiàn)在1個(gè)病例上，雜合突變型（GA或CT）、純合突變型（AA或TT）合計(jì)為47.17%～53.27%，等位基因A和T均為24.53%～31.48%，提示基因位點(diǎn)突變?cè)谌巳褐惺欠浅Ｆ毡榈默F(xiàn)象，這種基因位點(diǎn)的突變可能會(huì)導(dǎo)致臨床阿司匹林藥效發(fā)生變化。目前，評(píng)價(jià)阿司匹林藥效相關(guān)檢測包括實(shí)驗(yàn)室抵抗、臨床抵抗和基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測，而基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測與實(shí)驗(yàn)室抵抗、臨床抵抗是不同層面上的檢測，基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測是在遺傳學(xué)基礎(chǔ)上進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)室抵抗是通過體外模擬凝血激活途徑評(píng)價(jià)血小板聚集率，臨床抵抗是發(fā)生新的血管事件，三者之間存在相關(guān)性，但是又不等同，前兩者的檢測都是為了避免出現(xiàn)臨床抵抗的嚴(yán)重現(xiàn)象。

綜上所述，阿司匹林藥效相關(guān)基因GPⅠaG873A、C807T位點(diǎn)在人群中存在的突變現(xiàn)象較為常見，突變存在個(gè)體差異。另外，糖尿病患者純合突變型發(fā)病率高于心血管疾病患者和腦血管疾病患者，基因多態(tài)性分布和等位基因分布與患者性別、年齡無關(guān)。2個(gè)基因位點(diǎn)純合突變型、雜合突變型可能會(huì)影響臨床阿司匹林抗血小板治療效果，需密切關(guān)注，必要時(shí)建議更換抗血小板治療藥物。