EPHA1在骨肉瘤中的表達(dá)及其與預(yù)后相關(guān)性的生物信息學(xué)分析

江長(zhǎng)幸，蘇元港，宋德志,2，徐家科,2，陳蔚蔚

(1.廣西再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021；2.生物醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院，西澳大利亞大學(xué)，澳大利亞 珀斯 6009；3.廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021)

0 引言

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)，被認(rèn)為起源于骨形成間充質(zhì)干細(xì)胞，是最常見的原代骨惡性腫瘤，主要累及兒童和青年的長(zhǎng)骨干骺端[1-5]。目前的OS治療方案包括新輔助化療、廣泛的原發(fā)腫瘤手術(shù)切除和術(shù)后輔助化療。盡管采取了這些強(qiáng)有力的治療措施，OS患者的生存率在過去的40年里一直在提高，患者的5年生存率從1980年代以前的約20%提高到目前的約70%，但是轉(zhuǎn)移性浸潤(rùn)患者的5年生存率為20%-30%[6-8]，且一半的患者仍然不能存活超10年。雖然已有研究發(fā)現(xiàn)了一些易導(dǎo)致OS的遺傳腫瘤抑制基因，如TP53、RB1、RECQL4、BLM和WRN等[9-11]，但相對(duì)于其他癌癥，OS中腫瘤的異質(zhì)性較大，具有復(fù)雜和不穩(wěn)定的基因組結(jié)構(gòu)，為腫瘤治療帶來了一些難題[12-16]，因此確定可靠的生物標(biāo)志物，可為骨肉瘤的治療提供新的可能。

促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)肝細(xì)胞激酶受體A1(erythropoietinproducing hepatocyte kinase receptor A1，EPHA1)作為經(jīng)典的癌基因[17]，最初是從促紅細(xì)胞生成素的肝癌細(xì)胞系中分離出來的。EPHA1在人類癌癥中的表達(dá)水平是可變的，在某些類型的腫瘤中已有報(bào)道EPHA1的過度表達(dá)，包括卵巢癌和頭部鱗狀細(xì)胞癌和頸部，而在前列腺癌細(xì)胞系，乳腺癌細(xì)胞系以及皮膚的基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌中檢測(cè)到表達(dá)降低[18]。然而，EPHA1在骨肉瘤中的表達(dá)和作用尚不清楚，因此，本研究將利用已有的GEO等數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘 EPHA1 基因的相關(guān)信息，探討其與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及臨床預(yù)后的意義。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

a、在GEPIA2在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia2.cancer-pku.cn/#general)中檢索EPHA1，分析其在各類腫瘤中的表達(dá)情況；b、基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)在多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，里面存有大量轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)、甲基化等數(shù)據(jù)信息，使用“osteosarcoma”在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，然后在檢索的結(jié)果中篩選出包含完整生存數(shù)據(jù)和臨床信息，且樣本量大于40的微陣列數(shù)據(jù)集，下載其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相應(yīng)的平臺(tái)注釋文件，最后我們選擇了樣本量為47的數(shù)據(jù)集GSE39058，并下載了其平臺(tái)注釋文件GPL14951。

1.2 數(shù)據(jù)篩選和處理

利用R軟件(版本3.6.1，https://www.r-project.org/)讀取下載的微陣列數(shù)據(jù)集，mRNA探針信息由平臺(tái)文件GPL14951進(jìn)行注釋，刪除相應(yīng)的注釋信息，如探針名，保留已經(jīng)注釋的基因名。對(duì)于有重復(fù)的基因名，用R的“l(fā)imma“包將其平均化，然后用“normalizeBetweenArrays”函數(shù)對(duì)組間進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正，并提取EPHA1的表達(dá)量。從原始數(shù)據(jù)集中提取臨床信息文件，包括性別、年齡和腫瘤壞死面積。

1.3 EPHA1在骨肉瘤中的預(yù)后情況和效能評(píng)估

EPHA1在骨肉瘤中的生存曲線是利用R軟件中的“survival”包分析和繪制，以EPHA1表達(dá)量的中位數(shù)將數(shù)據(jù)集分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，log-rank檢驗(yàn)分析其顯著性。利用R的“survivalROC”包繪制受試者特征曲線(ROC)，來評(píng)估EPHA1預(yù)測(cè)骨肉瘤患者1年、3年和5年生存率的準(zhǔn)確性。

1.4 EPHA1與骨肉瘤臨床性狀的相關(guān)性分析

利用R的“Survival”包進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，將EPHA1和臨床特征值(年齡、性別和壞死面積)納入回歸模型，其中年齡以15歲作為二分類劃分標(biāo)準(zhǔn)，壞死面積以60%作為二分類劃分標(biāo)準(zhǔn)，篩選出骨肉瘤中具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值的因素。

1.5 EPHA1高低表達(dá)組差異基因的鑒定

使用R的“l(fā)imma”包對(duì)已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析，差異的類別是EPHA1高表達(dá)組(n=24)和低表達(dá)組(n=23)，分別使用倍數(shù)變化(fold change，F(xiàn)C)和學(xué)生t檢驗(yàn)對(duì)差異基因(DEGs)進(jìn)行篩選，以|log2FC|＞1和P＜0.05篩選出滿足要求的DEGs，并用R的“heatmap”包繪制出滿足條件的DEGs表達(dá)聚類熱圖以及全部DEGs的火山圖，用紅色表示基因高表達(dá)，綠色表示基因低表達(dá)。然后用“corrplot“包繪制出滿足條件的DEGs的相關(guān)性圖，紅色表示正性相關(guān)，綠色表示負(fù)性相關(guān)。

1.6 DEGs的GO和KEGG富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體論(GO)富集和京都基因與基因組百科(KEGG)通路分析，用于探究EPHA1高低表達(dá)組間的生物學(xué)功能差異，閾 值設(shè)定為P＜0.05，輸入DEGs，選擇 種屬“Homo sapiens”，然后選擇功能注釋工具進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

本研究采用R軟件(v3.6.1)完成統(tǒng)計(jì)分析，生存分析曲線采用Kaplan-Meier法繪制，以log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，Cox回歸分析用來篩選獨(dú)立預(yù)后因子，相關(guān)性分析采用皮爾森相關(guān)性分析，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)確定臨床病理和EPHA1表達(dá)數(shù)據(jù)的差異，所有分析均P＜0.05具有顯著差異性。

2 結(jié)果

2.1 EPHA1在各類腫瘤中的表達(dá)情況

在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索顯示，EPHA1在各類腫瘤中表達(dá)具有不同程度的差異，不同腫瘤中存在有的高表達(dá)，有的低表達(dá)的現(xiàn)象。其中EPHA1在食管癌的癌旁組織中表達(dá)量最大，差異最為明顯(圖1)。

圖1 EPHA1在各腫瘤中的表達(dá)

2.2 EPHA1在骨肉瘤中的生存分析及評(píng)價(jià)

在GSE39058數(shù)據(jù)集中，對(duì)整體數(shù)據(jù)集分析后發(fā)現(xiàn)，Kaplan-Meier法繪制的生存曲線中EPHA1高表達(dá)組的總體生存率顯著低于低表達(dá)組(P=0.002)(圖2A)，且與時(shí)間相關(guān)的ROC曲線顯示EPHA1在骨肉瘤患者1年、3年和5年生存率上具有很好的預(yù)測(cè)能力，ROC曲線下面積分別是0.805、0.738和0.663(圖2B)。

圖2 AEPHA1在骨肉瘤中生存曲線 B骨肉瘤患者的1、3、5年生存率的ROC曲線

2.3 EPHA1與臨床性狀的聯(lián)系

將臨床性狀特征值以及EPHA1納入Cox回歸模型中，經(jīng)過單因素和多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)EPHA1在骨肉瘤中具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值(HR=12.65，95%CI：2.89～55.31，P＜0.001)(表1)。將EPHA1放入每個(gè)臨床特征值的亞組中，進(jìn)一步探索EPHA1與骨肉瘤臨床性狀之間的關(guān)系，最后發(fā)現(xiàn)EPHA1的表達(dá)存在明顯的性別差異，男性患者的EPHA1表達(dá)顯著高于女性患者(P＜0.001)(圖3)。

表1 EPHA1及臨床性狀間的Cox回歸分析結(jié)果

圖3 骨肉瘤患者中EPHA1在不同性別中的表達(dá)

2.4 EPHA1高低表達(dá)組的差異分析

用EPHA1的中位表達(dá)量將數(shù)據(jù)集劃分為高低表達(dá)組，其中高表達(dá)組含有24例樣本，低表達(dá)組有23例樣本，經(jīng)“l(fā)imma”包差異分析后，以 |log2FC|＞1和P＜0.05條件篩選出254個(gè)DEGs，其中包括244個(gè)上調(diào)基因和10個(gè)下調(diào)基因，DEGs主要以上調(diào)為主。熱圖展示的是符合條件的DEGs表達(dá)量聚類情況(圖4A)，火山圖展示的是所有基因的差異情況(圖4B)，皮爾森相關(guān)性圖展示了DEGs之間的相關(guān)性(圖4C)，紅色代表正相關(guān)，綠色代表負(fù)相關(guān)，大部分DEGs表現(xiàn)出正相關(guān)性。

圖4 A EPHA1高低表達(dá)組的DEGs表達(dá)量聚類熱圖 BEPHA1高低表達(dá)組的所有基因的差異火山圖 C EPHA1高低表達(dá)組DEGs之間的皮爾森相關(guān)性圖

2.5 DEGs的功能富集分析

為了解EPHA1高低表達(dá)組間的DEGs的生物學(xué)功能和通路情況，我們使用了DAVID生物信息學(xué)工具對(duì)DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析，GO富集結(jié)果顯示，生物學(xué)功能(BP)主要富集在轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄和啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等，分子功能(MF)主要富集在啟動(dòng)子近端序列特異性DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活子活性和GTP活性等，此外，在細(xì)胞成分(CC)上也有富集，在胞質(zhì)、細(xì)胞外泌體和吞噬小泡上有明顯富集(圖5A)。而KEGG通路則主要富集在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)信號(hào)通路、吞噬體和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的通路上(圖5B)。

圖5 EPHA1高低表達(dá)組間的DEGs的GO和KEGG富集分析

3 討論

本研究通過數(shù)據(jù)挖掘分析EPHA1與骨肉瘤之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)EPHA1在骨肉瘤中具有較好生存意義，Kaplan-Meier生存曲線顯示，骨肉瘤患者中，EPHA1高表達(dá)的患者生存率顯著低于EPHA1低表達(dá)的患者，提示EPHA1高表達(dá)在骨肉瘤患者的預(yù)后中是一個(gè)危險(xiǎn)因素，單因素和多因素Cox回歸分析也顯示EPHA1在骨肉瘤中是一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素。在與臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性研究上，我們發(fā)現(xiàn)EPHA1在性別的亞組中表現(xiàn)出來了顯著差異，男性患者EPHA1的表達(dá)明顯高于女性患者，但是，這種現(xiàn)象并非是在骨肉瘤中出現(xiàn)。Xiaolin Wang團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，在腎透明細(xì)胞癌中，EPHA1在男性和女性中也具有明顯的表達(dá)差異[19]，因此EPHA1在性別中的差異表達(dá)可作為提高骨肉瘤個(gè)體化治療預(yù)后的新方向。在GSE39058數(shù)據(jù)集中，EPHA1的1年、3年和5年ROC曲線提示其在骨肉瘤中具有較好的預(yù)測(cè)能力，表明EPHA1在骨肉瘤預(yù)后分析中具有一定的研究?jī)r(jià)值。差異分析結(jié)果顯示，EPHA1高低表達(dá)組的大部分DEGs在疾病發(fā)生后表達(dá)發(fā)生上調(diào)，少部分的基因出現(xiàn)下調(diào)。GO和KEGG富集分析可以為我們進(jìn)一步探索EPHA1高低表達(dá)組間的功能差異提供研究方向，GO富集結(jié)果顯示DEGs主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和啟動(dòng)子調(diào)控，這可能極大程度地影響到細(xì)胞的代謝[20]，從而增加或者抑制細(xì)胞的增殖[21]。已有大量研究顯示，EPHA1的過度表達(dá)與多種癌癥有關(guān)，并參與了癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移過程[18,22,23]。KEGG富集分析結(jié)果也顯示，DEGs主要富集在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)信號(hào)通路、吞噬體和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等的通路上，而TGF-β信號(hào)通路則主要參與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞轉(zhuǎn)移和細(xì)胞凋亡等細(xì)胞過程[24,25]，也提示了EPHA1在骨肉瘤中，可能通過促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移促進(jìn)其發(fā)展，從而降低患者生存率。因此，EPHA1可作為骨肉瘤基因治療和改善預(yù)后以及開發(fā)骨肉瘤靶向藥物的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，EPHA1在骨肉瘤患者腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，且其高表達(dá)與骨肉瘤患者預(yù)后不良有關(guān)，因此EPHA1可作為預(yù)測(cè)骨肉瘤患者預(yù)后不良的分子標(biāo)記物。