大花蔥愈傷組織誘導(dǎo)分化及不定芽增殖研究

陳 權(quán) 陳慧蘭 張承妹 （上海孫橋現(xiàn)代溫室種子種苗有限公司，上海 201210）

申瑞雪 李秋靜 龐玉華 （上海上房園林植物研究所有限公司，上海 201114）

大花蔥又名吉安花，是百合科蔥屬多年生球根花卉，根鱗莖肉質(zhì)，有蔥味。大花蔥原產(chǎn)亞洲中部，在世界各國(guó)園林綠化中多有種植，主要用于花境、巖石園或草坪旁的裝飾和美化，是同屬植物中觀賞價(jià)值較高的一種。目前，我國(guó)大花蔥的某些新優(yōu)品種的種球主要依賴(lài)進(jìn)口，但由于價(jià)格較貴，不宜大批量引進(jìn)。大花蔥的常規(guī)繁殖依靠種子繁殖和分株繁殖，其中，種子繁殖從播種到開(kāi)花所經(jīng)歷的時(shí)間較長(zhǎng)，而分株繁殖形成的子球大小不一，且繁殖速度較慢，難以滿足市場(chǎng)需求。因此，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培育大花蔥種苗、種球是解決大花蔥繁殖問(wèn)題的可靠途徑。但目前，有關(guān)大花蔥組織培養(yǎng)方面的研究國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道，鑒于此，筆者對(duì)大花蔥愈傷組織誘導(dǎo)、分化及不定芽增殖的相關(guān)技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行了研究，以期為今后建立大花蔥組培種球繁殖技術(shù)體系進(jìn)行技術(shù)積累。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為大花蔥鱗球莖，由上海上房園林植物研究所有限公司提供，品種為“舒伯特”。取材時(shí)間為2020年1月。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒

選擇天氣晴好的中午，將種植在田間的大花蔥鱗球莖完整挖出，去除泥土后帶回實(shí)驗(yàn)室。先將鱗球莖頂部的葉片及基部的根系剔除干凈，再將外表皮剝?nèi)?，在加入洗潔精的清水中浸? min，然后在流水下沖洗45 min。在超凈工作臺(tái)上先用75%酒精震蕩消毒30 s，再分別用0.05%、0.1%的升汞，分別消毒10、15、20 min，在消毒劑中加入2～3滴吐溫-20，消毒結(jié)束后用無(wú)菌水清洗5次，時(shí)間為5 min，最后用無(wú)菌紗布吸干表面水分待接種。30 d后統(tǒng)計(jì)外植體成活率，外植體成活率（%）=（成活數(shù)量÷接種數(shù)量）×100。

1.2.2 初代培養(yǎng)

將消毒后的大花蔥鱗球莖切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，接種在不同激素濃度及配比的MS培養(yǎng)基上，依據(jù)培養(yǎng)基配方不同共設(shè)5個(gè)處理，分別為：（1）6-BA 0.25 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L；（2）6-BA 0.25 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L；（3）6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L ；（4）6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L；（5）6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。各培養(yǎng)基配方均添加白砂糖30 g/L、瓊脂5 g/L，pH均為6.0。處理（1）、（2）、（3）、（4）采用二步法，即先暗培養(yǎng)3 d再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，10 d后均轉(zhuǎn)入MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+白砂糖30 g/L培養(yǎng)基中；處理（5）采用一步法，即直接在以6-BA和NAA為激素組合的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)。光照培養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃、光照時(shí)間12 h/d、光照強(qiáng)度3 000 Lux。30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率，愈傷誘導(dǎo)率（%）=（出愈傷塊莖數(shù)量÷接種塊莖數(shù)量)×100。

1.2.3 分化培養(yǎng)

將初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)產(chǎn)生的質(zhì)地致密的愈傷組織塊均割，然后轉(zhuǎn)接到不同激素配比的MS培養(yǎng)基上，依據(jù)培養(yǎng)基配方不同共設(shè)4個(gè)處理，分別為：（1）6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；（2）6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；（3）6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；（4）6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。各培養(yǎng)基配方均添加白砂糖30 g/L、瓊脂5 g/L，pH均為6.0。光照培養(yǎng)條件同1.2.2。30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率，不定芽誘導(dǎo)率（%）=（出芽愈傷數(shù)量÷愈傷接種數(shù)量）×100。

1.2.4 叢芽增殖培養(yǎng)

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽及致密愈傷組織接種在不同激素配比的MS培養(yǎng)基上，依據(jù)培養(yǎng)基配方不同共設(shè)5個(gè)處理，分別為：（1）6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L ；（2）6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；（3）6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；（4）6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L ；（5）6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。各培養(yǎng)基配方均添加白砂糖30 g/L、瓊脂5 g/L，pH均為6.0，光照培養(yǎng)條件同1.2.2。30 d后統(tǒng)計(jì)芽增殖倍數(shù)，芽增殖倍數(shù)=繼代切割后接種數(shù)量÷繼代前芽叢數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度升汞和消毒時(shí)間對(duì)大花蔥外植體的消毒效果

由于大花蔥鱗球莖是直接從田間土壤中取得的，而土壤中存在各種微生物，且外植體消毒較為困難，故本試驗(yàn)中采用滲透性強(qiáng)、消毒效果好的升汞溶液進(jìn)行消毒。由表1可知，采用濃度為0.1%升汞消毒20 min的外植體無(wú)菌率最高，達(dá)70.0%，但由于消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，部分外植體死亡，外植體成活率降低。經(jīng)綜合考慮，以濃度為0.1%的升汞消毒15 min的消毒效果為最佳，外植體成活率達(dá)62.5%。

表1 不同濃度升汞和消毒時(shí)間對(duì)大花蔥外植體的消毒效果

2.2 不同激素配比對(duì)大花蔥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2可知，處理（1）、（2）、（3）、（4）采用二步法，即先在含2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，然后轉(zhuǎn)入不含2,4-D的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)率均達(dá)70%以上，而處理（5）采用一步法，即直接在以6-BA和NAA為激素組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其誘導(dǎo)效果較差，誘導(dǎo)率僅為26.7%。經(jīng)綜合考慮，大花蔥愈傷組織誘導(dǎo)宜采用二步法，即先在以6-BA 0.5 mg/L和2,4-D 2.0 mg/L為激素組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，再轉(zhuǎn)入MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+白砂糖30 g/L培養(yǎng)基中，該方法誘導(dǎo)率最高，達(dá)93.3%，且形成的愈傷組織致密，后期形成顆粒狀愈傷，有利于再分化形成不定芽。

表2 不同激素配比對(duì)大花蔥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 不同激素配比對(duì)大花蔥愈傷分化不定芽的影響

由表3可知，在培養(yǎng)基中添加較高濃度的6-BA，愈傷組織塊形成不定芽的比例較高，但隨著6-BA濃度的進(jìn)一步提高，形成的不定芽形態(tài)差、葉片彎曲畸形，出現(xiàn)明顯的玻璃化現(xiàn)象。表明在愈傷組織誘導(dǎo)不定芽階段，過(guò)高濃度的細(xì)胞分裂素不利于形成有效的不定芽，6-BA濃度以控制在2.0 mg/L以?xún)?nèi)較為適宜。經(jīng)綜合考慮，以6-BA 2.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L的激素配比，對(duì)愈傷組織分化不定芽的效果最好，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)77.8%。

表3 不同激素配比對(duì)大花蔥愈傷組織分化不定芽的影響

2.4 不同激素配比對(duì)大花蔥不定芽增殖的影響

由表4可知，以在添加6-BA 3.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L的MS培養(yǎng)基上，不定芽的增殖倍數(shù)最高。據(jù)觀察，質(zhì)地較好的愈傷組織在接種15 d后，表面逐漸產(chǎn)生顆粒狀突起，在接種20 d后陸續(xù)產(chǎn)生叢生芽，單芽接種在此培養(yǎng)基上也能取得很好的增殖效果，產(chǎn)生的叢生芽葉色濃綠、無(wú)玻璃化現(xiàn)象。當(dāng)6-BA濃度低于2.0 mg/L時(shí)，芽增殖不明顯，增殖倍數(shù)較低；當(dāng)6-BA濃度達(dá)到4.0 mg/L時(shí)，芽的增殖倍數(shù)并沒(méi)有繼續(xù)增加，反而有所降低，且芽出現(xiàn)畸形葉片，說(shuō)明過(guò)高或過(guò)低的激素水平都不利于叢芽增殖。經(jīng)綜合考慮，以6-BA 3.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L的激素配比，對(duì)不定芽的增殖效果最好，芽增殖倍數(shù)達(dá)2.65倍。

表4 不同激素配比對(duì)大花蔥不定芽增殖的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以大花蔥鱗球莖為外植體，對(duì)大花蔥愈傷組織誘導(dǎo)分化以及不定芽增殖的相關(guān)技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，大花蔥外植體消毒以濃度為0.1%的升汞消毒15 min的消毒效果較佳，外植體成活率達(dá)62.5%；大花蔥愈傷組織誘導(dǎo)宜采用二步法，即先在以6-BA 0.5 mg/L和2,4-D 2.0 mg/L為激素組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，再轉(zhuǎn)入MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+白砂糖30 g/L培養(yǎng)基中，其誘導(dǎo)率較高，達(dá)93.3%，且形成的愈傷組織致密，后期形成顆粒狀愈傷，有利于再分化形成不定芽；在愈傷組織再分化階段，過(guò)高濃度的細(xì)胞分裂素不利于形成有效的不定芽，6-BA的濃度以控制在2.0 mg/L以?xún)?nèi)較為適宜，以6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的激素配比較為適宜，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)77.8%。同時(shí)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在大花蔥愈傷組織分化階段，為控制玻璃苗的發(fā)生，將6-BA的濃度控制在2.0 mg/L，但經(jīng)過(guò)2～3次繼代培養(yǎng)后，叢生芽的增殖比例明顯下降，需提高6-BA的濃度，故在大花蔥不定芽增殖階段，以6-BA 3.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L的激素配比，芽的增殖效果較好，增殖倍數(shù)達(dá)2.65倍。可見(jiàn)，在大花蔥組培時(shí)芽增殖過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)苗的長(zhǎng)勢(shì)，適時(shí)調(diào)整激素配比，以獲得理想的增殖效果。