火麻仁油及大麻二酚對抑郁模型小鼠行為及炎癥反應(yīng)的影響

王語聰，謝智鑫，李春雨，王宇晴，陳曉偉，韓建春,2,

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江哈爾濱 150028)

火麻仁又稱大麻仁，是大麻(Cannabis sativaL.)果實(shí)干燥成熟種子，為藥食同源物質(zhì)，其富含植物蛋白、膳食纖維及多元不飽和脂肪酸，因其含有豐富的碳水化合物，可為機(jī)體提供能量，被廣泛用作食品的輔料及動物飼料[1]。藥典記載為潤腸通便藥材，有較好的潤燥通便效果[2]?；鹇槿视妥鳛榛鹇槿食Ｒ姷募庸ぎa(chǎn)品之一，因其內(nèi)含有大量不飽和脂肪酸如油酸、亞油酸和α-亞麻酸等不飽和脂肪酸，因此具有降血脂[3]、抗氧化[4]和改善記憶[5]等功效，被大多數(shù)人作為典型的藥食同源物及養(yǎng)生食材、臨床用藥材。大麻二酚(cannabidiol，CBD)作為火麻仁油中的酚類物質(zhì)之一，在火麻仁油中約占5 mg/kg[6]。火麻仁油的營養(yǎng)特性與多不飽和脂肪酸含量有關(guān)，且主要與CBD的存在有關(guān)[7]。臨床研究表明，CBD可快速透過血腦屏障，可作為一種由壓力引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療藥物[8]，有效地治療關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、慢性疼痛、精神分裂癥和癲癇，近年被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療[9-12]。Sartim等[13]通過小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，CBD能夠降低小鼠靜止不動的時間，首次證實(shí)其可能具有抗抑郁作用。但是對于CBD來源物質(zhì)——火麻仁油能否減輕抑郁癥的方面未見有研究報(bào)道。

抑郁癥的形成原因十分復(fù)雜，研究證實(shí)抑郁癥與炎癥因子存在密切關(guān)系[14]。為了探尋作為食品的火麻仁油對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用，本研究從火麻仁油中提取其有效成分CBD，以慢性不可預(yù)測的輕度應(yīng)激(Chronic unpredictable mild stress，CUMS)模型小鼠為受試對象，通過連續(xù)灌胃給予小鼠火麻仁油和CBD 8周，觀測小鼠的焦慮癥狀、學(xué)習(xí)和認(rèn)知行為，檢測小鼠海馬及皮層炎癥因子mRNA表達(dá)量及顯微觀察，探究火麻仁油和CBD能否緩解小鼠的抑郁行為和神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，旨在火麻仁油在藥食同源開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

3周齡C57BL/6雄性小鼠(合格證：No.110324 1911) 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；火麻仁 黑龍江(孫吳)火麻產(chǎn)業(yè)園，產(chǎn)品安全及其質(zhì)量要求均符合國家相關(guān)規(guī)定，火麻仁油由傳統(tǒng)壓榨技術(shù)獲得；CBD 由實(shí)驗(yàn)室制取，采用柱料A:Seplite LX-100B，粒子尺寸0.4～1.2 mm、柱料B:Seplite LXBC02，粒子尺寸50～100 μm，通過APPS MV全自動層析純化系統(tǒng)從火麻仁油中分離純化得到，純度99%以上；CBD標(biāo)準(zhǔn)品 美國SIGMA-ALDRICH公司；mRNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RTPCR試劑盒 中國寶生物工程有限公司；DAB顯色 北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；IBA-1抗體和二抗 美國Abcam公司。

離心機(jī) 賽默飛世爾科技(中國)有限公司；QuantStudio 3D型數(shù)字PCR儀 美國Life Technologies公司；光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯公司；高架十字迷宮 上海欣軟信息科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及干預(yù) 將3周齡雄性C57BL/6小鼠于22±2 °C、濕度50%±10%下，自由采食和飲水，12 h光/暗周期進(jìn)行為期2周的適應(yīng)性喂養(yǎng)。所有的試驗(yàn)步驟遵循試驗(yàn)動物護(hù)理以及動物協(xié)議，由西安交通大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)[15]。將全部喂食標(biāo)準(zhǔn)飲食(AIN-93M)并分成五組，每組10只。CBD低劑量組(濃度為15 mg/kg)、CBD高劑量組(濃度為30 mg/kg)、火麻仁油組(劑量3 mL/kg，液相色譜分析可知CBD的濃度為4.7 mg/kg)均溶解于橄欖油中，以10 mL/kg/d劑量進(jìn)行灌胃，并同時暴露于慢性不可預(yù)測的輕度應(yīng)激(Chronic unpredictable mild stress，CUMS)程序；模型組按照上述劑量灌胃等體積的橄欖油，并暴露于CUMS程序；空白組僅灌胃等體積的橄欖油。其中CBD劑量的選擇是根據(jù)Shoval等[16]探究CBD對于抑郁模型小鼠的享樂效用中效果較好的劑量濃度選取15、30 mg/kg?；鹇槿视蛣┝康囊罁?jù)是李根林等[17]探究火麻仁油對D-半乳糖衰老小鼠模型的研究中選取3 mL/kg以及魏月媛等[18]探究火麻仁油毒理學(xué)采用90 d大鼠亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)期間動物一切正常無不良反應(yīng)，說明火麻仁油不具有亞慢性毒性。

在兩周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，除空白組外，進(jìn)行CUMS程序[19]。其程序?yàn)椋好恐芙o予小鼠7種(S1～S7)不同刺激。S1：1 min懸尾(距尾尖1 cm)；S2：光照(24 h)；S3：傾斜籠子(30 °)；S4：禁食(24 h)；S5：禁水(24 h)；S6：濕墊料(200 mL純凈水)；S7：冷水游泳(4 ℃、5 min)。每周隨機(jī)且不重復(fù)選擇刺激方式的順序。

各分組小鼠于每日刺激前30 min進(jìn)行灌胃，直到8周后CUMS處理程序結(jié)束時為止，試驗(yàn)期間小鼠自由采食和飲水。在最后兩周進(jìn)行多種行為學(xué)測試，且測試在給藥后1 h進(jìn)行，以確定壓力模型成功建立。在行為測試后處死小鼠，并用氯水合物誘導(dǎo)麻醉，取眼球血和腦部組織，分離紋狀體、腦海馬、前額皮質(zhì)組織等，保存于-80 °C冰箱中，備用。所有手術(shù)均處于麻醉狀態(tài)，并盡一切努力使疼痛最小化。

1.2.2 小鼠抑郁行為測試

1.2.2.1 蔗糖偏好測試 蔗糖偏好測試反映小鼠的愉悅感。在建模成功后第1 d對小鼠進(jìn)行為期3 d蔗糖偏好適應(yīng)性訓(xùn)練，其中第1 d為兩瓶純凈水，第2 d將其中一瓶更換為1%的蔗糖水，第3 d進(jìn)行為期24 h禁食后蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)，放置兩瓶分別為1%蔗糖溶液和純凈水的等量溶液，經(jīng)過24 h后記錄兩瓶溶液的消耗量并進(jìn)行計(jì)算，公式如下：

蔗糖偏愛程度(%)=糖水消耗量/(糖水消耗量+普通水消耗量)×100

1.2.2.2 強(qiáng)迫游泳測試 強(qiáng)迫游泳是根據(jù)小鼠的靜止時間從而反映小鼠的絕望程度[20]。在建模成功后第2 d進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，總時長為6 min，用攝像系統(tǒng)記錄動物在實(shí)驗(yàn)后的4 min內(nèi)保持不動時間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將小鼠吹干后放回籠中。

1.2.2.3 懸尾測試 懸尾測試是為了反映小鼠的焦慮程度[21]。在建模成功后第3 d進(jìn)行測試。在用固定貼紙將小鼠尾尖部2 cm處固定于懸尾箱頂部，將小鼠身體調(diào)整至倒立狀態(tài)，使其頭部距離箱底部50 cm左右，總時長為6 min，用攝像系統(tǒng)記錄動物在實(shí)驗(yàn)的后3 min內(nèi)保持不動時間。為避免外環(huán)境所帶來的實(shí)驗(yàn)誤差，整個記錄過程需要小鼠一直處于觀察不到操作人員的狀態(tài)。

1.2.3 小鼠焦慮行為測試

1.2.3.1 曠場測試 曠場測試是為了反映小鼠在陌生環(huán)境中的自主性和探索能力[20]。在運(yùn)動監(jiān)測籠中使用帶紅外傳感器的數(shù)字計(jì)數(shù)器測量小鼠的自發(fā)活動。建模成功后第4 d進(jìn)行，將每只小鼠放置在設(shè)備的中心并允許自由探索5 min。整個過程都進(jìn)行了視頻記錄，稍后通過前面提到的計(jì)算機(jī)化視頻跟蹤系統(tǒng)分析總距離和線路交叉總數(shù)(運(yùn)動活動)進(jìn)行分析。每只小鼠進(jìn)行測試后，清理排泄物并用酒精擦拭以便氣味帶來實(shí)驗(yàn)偏差。

1.2.3.2 高架十字迷宮測試 高架十字實(shí)驗(yàn)也是反映小鼠焦慮程度的一種測定方法[22]。建模成功后第5 d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，小鼠在視頻監(jiān)控下自動移動，利用設(shè)備和相關(guān)軟件記錄數(shù)據(jù)，例如小鼠的移動路線、速度、總距離和臂數(shù)。每只小鼠的測試時間為5 min，測試結(jié)果基于小鼠張開雙臂停留的時間和距離。

1.2.4 小鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知行為測試

1.2.4.1 Y迷宮測試 Y迷宮主要是探索小鼠的記憶能力[23]。建模成功后第6 d進(jìn)行小鼠在視頻監(jiān)控下自動移動，利用設(shè)備和相關(guān)軟件記錄數(shù)據(jù)，例如其移動路線、速度、總距離和臂數(shù)。每只小鼠的測試時間為5 min，計(jì)算結(jié)果為交替百分比：

交替百分比(%)=不重復(fù)進(jìn)入三個交叉臂的總次數(shù)/(進(jìn)臂總次數(shù)-1)×100

1.2.4.2 新物體識別測試 新物體識別是反映小鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力[24]。建模成功后第7 d將小鼠放在一個開放的立方體箱中央，該立方體箱長40 cm、寬40 cm、高50 cm。實(shí)驗(yàn)分為適應(yīng)期、訓(xùn)練期和測試期。小鼠在視頻監(jiān)控設(shè)備下自由移動，記錄數(shù)據(jù)。在實(shí)驗(yàn)測試期間，酒精鼠標(biāo)盒和物體的氣味被用來防止實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錯誤。

1.2.5 腦部皮層和海馬mRNA提取和檢測 用Trizol抽提法[25]提取腦組織中總RNA并用逆轉(zhuǎn)錄酶PrimeScriptTM RT合成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過SYBR green PCR試劑盒測量mRNA表達(dá)，并使用CFX96TM系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時檢測。兩步PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)程序：95 ℃ 30 s，循環(huán)1次；95 °C 3 s；60 °C 30 s循環(huán)40次；進(jìn)入溶解曲線階段。小鼠源前后端引物示如表1。用GAPDH的mRNA作為內(nèi)參，2-ΔΔCt計(jì)算基因相對表達(dá)量。

表1 半定量RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for semi-quantitative RT-PCR analysis

1.2.6 海馬組織切片的病理學(xué)觀察 小鼠在處死后立即取出腦組織，取左腦并將其固定在4%(v/v)PBS固定劑中24 h，脫水后包埋于石蠟中進(jìn)行切片。將切片置于二甲苯中進(jìn)行脫蠟，然后用梯度乙醇水化，并用PBS洗滌5次，每次4 min。為防止特異性染色，通過添加含有3%的過氧化氫去離子水處理10 min，使內(nèi)源酶活性失活，然后與一抗孵育過夜。用PBS洗滌5次后，加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白素工作液孵育20 min，然后加入DAB工作液進(jìn)行顯色反應(yīng)10 min。切片用蘇木精復(fù)染。將切片在梯度乙醇中脫水后，在二甲苯中澄清，樹脂密封，并在光學(xué)顯微鏡觀察(200×)上觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Iamge J軟件處理圖像，Graphpad Prism8、IBM SPSS Statistics 20軟件分析相關(guān)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SEM)，并且每個實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)至少3次，P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 火麻仁油和CBD對模型小鼠抑郁行為學(xué)的影響

如表2所示，在懸尾實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比，模型組靜止不動時間顯著上升(P<0.05)，與模型組相比，CBD低、高劑量組分別極顯著(P<0.01)、顯著(P<0.05)低于模型組小鼠的靜止不動時間，但火麻仁油劑量組無差異性顯著(P>0.05)。根據(jù)強(qiáng)迫游泳的數(shù)據(jù)分析，與空白組相比，模型組小鼠靜止不動的時間顯著延長(P<0.05)；與模型組相比，CBD劑量組均極顯著低于模型組(P<0.01)，但火麻仁油劑量組無差異性顯著(P>0.05)。通過蔗糖偏好數(shù)據(jù)可知，與空白組相比，模型組小鼠喜愛蔗糖程度顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，火麻仁油劑量組和CBD低劑量組顯著升高(P<0.05)，CBD高劑量組極顯著升高(P<0.01)。

表2 各組小鼠抑郁行為學(xué)指數(shù)Table 2 Behavioral index of mice in each group

抑郁癥的主要表現(xiàn)為情緒低落、興趣喪失、活動減少、飲食和思維的改變等[26]。經(jīng)過八周建模，蔗糖偏好表明小鼠愉悅感的獲得和喪失程度，抑制小鼠糖水偏好度降低。懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳表明小鼠在緊張的環(huán)境下產(chǎn)生的抑郁與絕望狀態(tài)。通過實(shí)驗(yàn)可以看出，火麻仁油和CBD劑量組的小鼠均能夠增加小鼠對糖水的喜愛程度，且CBD劑量組能夠減少靜止不動的時間，證明火麻仁油及CBD能夠改善CUMS模型小鼠抑郁行為。

2.2 火麻仁油和CBD對模型小鼠焦慮行為學(xué)的影響

根據(jù)高架十字迷宮開放臂與閉合臂時間比和路程比數(shù)據(jù)(表3)可得，與空白組相比，模型組極顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，CBD劑量組均極顯著上升(P<0.01)，但火麻仁油組不存在顯著差異(P>0.05)。

表3 各組小鼠焦慮行為學(xué)指數(shù)Table 3 Behavioral index of mice in each group

高架十字迷宮是評價動物焦慮反應(yīng)的一種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，利用動物對環(huán)境改變的特性探究和對高懸敞開臂的心理來形成小鼠的焦慮程度。曠場測試是為了增加小鼠自主神經(jīng)活動和探索能力[27]。本實(shí)驗(yàn)可知，與模型組相比，CBD劑量組高架十字迷宮開放臂與閉合臂的時間比和路程比有極顯著的上升(P<0.01)；曠場實(shí)驗(yàn)跨格數(shù)沒有顯著差異(P>0.05)，與Zanelati等[28]探究CBD對小鼠的抗抑郁作用的結(jié)果相一致。因此，CBD能夠改善CUMS模型小鼠的焦慮行為，效果好于火麻仁油組。

2.3 火麻仁油和CBD對模型小鼠認(rèn)知學(xué)習(xí)能力的影響

在新物體識別分辨指數(shù)實(shí)驗(yàn)中(結(jié)果見表4)，與空白組相比，模型組顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，火麻仁油組顯著升高(P<0.05)，CBD劑量組極顯著升高(P<0.01)。通過Y迷宮數(shù)據(jù)可知，與空白組相比，模型組顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，火麻仁油組不存在顯著差異(P>0.05)，但CBD劑量組均顯著上升(P<0.05)。

表4 各組小鼠認(rèn)知學(xué)習(xí)能力指數(shù)Table 4 Behavioral index of mice in each group

抑郁癥作為重要神經(jīng)類疾病，其發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，慢性不可預(yù)測的輕度壓力模型常用于研究病理及生理機(jī)制和抗藥的作用機(jī)制[29]。新物體識別和Y迷宮表達(dá)了認(rèn)知行為和學(xué)習(xí)能力。在認(rèn)知和學(xué)習(xí)能力方面，CBD劑量組明顯優(yōu)于火麻仁油組。綜上，相比于火麻仁油可改善由抑郁癥帶來的認(rèn)知、焦慮及學(xué)習(xí)行為，CBD有更強(qiáng)的作用。

2.4 小鼠皮層炎癥因子含量變化

如圖1所示，與空白組相比，模型組腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1β)水平均極顯著上升(P<0.01)；誘導(dǎo)NOS(iNos)mRNA水平均顯著上升(P<0.05)。與模型組相比，CBD劑量組TNF-α、iNos和IL-1β均顯著降低(P<0.05)，火麻仁油組IL-1β水平顯著下降(P<0.05)，火麻仁油組TNF-α、iNos水平無顯著差異(P>0.05)。

圖1 各組小鼠皮層TNF-α、iNos、IL-1β的mRNA水平(n=10)Fig.1 The mRNA levels of TNF-α, iNos and IL-1β in the mouse cortex of each group (n=10)

炎癥因子在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，當(dāng)免疫系統(tǒng)被激活時，免疫細(xì)胞會分泌多種炎癥細(xì)胞因子，作為免疫應(yīng)答及炎癥效應(yīng)因子，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生；IL-1β、TNF-α和iNos可以作為炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，在炎癥中發(fā)揮中心作用，當(dāng)免疫細(xì)胞被激活時釋放，腦部中其含量增加，引起神經(jīng)細(xì)胞損傷[30]。研究表明，火麻仁油及CBD可以顯著降低巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF，從而降低炎癥；李萃萃等[31]研究證實(shí)CBD能夠抑制脊髓損傷模型小鼠的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而對脊髓神經(jīng)功能起到保護(hù)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠皮層IL-1β、TNF-α及iNos的mRNA水平明顯降低，說明火麻仁油及CBD能夠改善小鼠腦神經(jīng)的炎癥狀態(tài)，與前人的研究結(jié)果相符。

2.5 小鼠海馬炎癥因子含量變化

如圖2所示，與空白組相比，模型組TNF-α、iNos和IL-1β均極顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，CBD劑量組TNF-α、iNos和IL-1β均顯著降低(P<0.05；P<0.01)，火麻仁油組IL-1β顯著下降(P<0.05)，火麻仁油組TNF-α、iNos無顯著差異(P>0.05)。

圖2 各組小鼠海馬TNF-α、iNos、IL-1β的mRNA水平(n=10)Fig.2 The mRNA levels of TNF-α, iNos and IL-1β in the hippocampus of each group of mice (n=10)

炎癥因子與抑郁癥的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，這些炎癥因子進(jìn)入大腦，影響與情緒情感調(diào)節(jié)有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，從而產(chǎn)生抑郁癥狀[32]。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)炎癥因子在抑郁癥的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，促炎因子顯著上調(diào)。越來越多的證據(jù)表明，抗炎藥物治療后抑郁癥狀明顯改善，促炎因子水平明顯降低。Li等[33]研究表明通過LPS誘導(dǎo)小鼠使其產(chǎn)生抑郁樣行為，經(jīng)抗抑郁藥物氟西汀治療后，促炎因子IL-1β和TNF-α含量均有顯著降低。Shelton等[34]采用微陣列分析對未治療的抑郁患者死后腦組織進(jìn)行研究表明，患者前額葉腦組織中的促炎因子和抗炎因子的表達(dá)量均有增加。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在小鼠腦部海馬部分，CBD劑量組中IL-1β、TNF-α及iNos的mRNA水平有著顯著降低(P<0.05)，同時抑郁小鼠的認(rèn)知功能得到改善，結(jié)合前人的研究結(jié)果，說明火麻仁油及CBD可能通過抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，來改善其認(rèn)知功能。

2.6 小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)

星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦部中主要的炎癥細(xì)胞之一，其活化程度反映了大腦中炎癥反應(yīng)的狀態(tài)。如圖3所示，相對于空白組，模型組的小鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增加；與模型組相比，火麻仁油和CBD劑量組星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)相對減少。由此可知，CBD抑制了小鼠海馬腦區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。

圖3 各組小鼠海馬CA1、CA3、DG和Cortex區(qū)域IBA-1的形態(tài)變化Fig.3 The morphological changes of hippocampus CA1, CA3, DG and Cortex IBA-1 in each group of mice

小膠質(zhì)細(xì)胞的離子化的鈣結(jié)合銜接分子1(IBA-1)是一種保護(hù)膠質(zhì)細(xì)胞的鈣類結(jié)合蛋白[35-36]，在腦部主要起到調(diào)節(jié)細(xì)胞因子及炎癥的作用，參與神經(jīng)和免疫功能[37]。由圖3中可明顯看出，CBD和火麻仁劑量均能降低IBA-1表達(dá)量，但CBD的劑量效果比火麻仁更好，說明火麻仁及CBD均能有效緩解小鼠海馬炎癥狀態(tài)。

3 結(jié)論

火麻仁油能夠提高模型小鼠抑郁行為及認(rèn)知能力，并且降低小鼠皮層和海馬炎癥因子iNos mRNA水平；CBD能改善CUMS模型小鼠的抑郁和焦慮行為，提升其學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能，抑制小鼠腦皮層和海馬的炎癥反應(yīng)。因此，本試驗(yàn)證明火麻仁油中的CBD具有改善抑郁癥狀的潛力。