蘋果渣飼料中展青霉素生物脫除的條件優(yōu)化及脫除前后飼料中營養(yǎng)物質(zhì)評價

楊 陽，鄒 東，紀(jì) 劍，王海鳴，張銀志，朱 璇 ，孫秀蘭,

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122；3.廣州廣電計(jì)量檢測股份有限公司，廣東廣州 510000)

展青霉素(Patulin，PAT)又稱棒曲霉毒素，分子式C7H6O4(如圖1)，是一種有毒的真菌次級代謝產(chǎn)物[1]，對人和動物有多種毒性[2-3]。研究表明展青霉素對大鼠和小鼠具有致癌、致畸、免疫毒性、基因毒性和神經(jīng)毒性等作用，可導(dǎo)致肝臟，脾臟和腎臟等損傷，嚴(yán)重威脅人和動物的健康[4-7]。鑒于展青霉素的毒性危害，世界上多個國家都制定了限定標(biāo)準(zhǔn)，我國規(guī)定蘋果汁和蘋果制品中展青霉素的最高含量不得超過50 μg/kg[8]；歐盟限定果汁產(chǎn)品中展青霉素的含量最高不得超過50 μg/kg，固體水果產(chǎn)品中最高不得超過25 μg/kg，兒童和嬰兒食品中不得超過10 μg/kg[9]；世界衛(wèi)生組織建議，人類每天攝入的展青霉素量不應(yīng)超過0.4 μg/kg[10]。因此，研究展青霉素的脫毒十分有必要。目前，展青霉素的脫毒方法主要為物理[11-12]、化學(xué)[13]和生物方法[14]。物理方法主要采用對原料的挑選清洗、微波處理和吸附雜質(zhì)等方式[15]，該方法需要耗費(fèi)大量的人力物力，成本較高，且容易造成原料中營養(yǎng)成分損失；化學(xué)方法主要為使用添加劑或化學(xué)殺菌劑等手段降低展青霉素的含量[16]，但該方法會破壞產(chǎn)品的品質(zhì)，造成農(nóng)藥殘留等二次污染問題；生物發(fā)酵法與這些方法相比具有經(jīng)濟(jì)、高效等特點(diǎn)，越來越吸引研究者的關(guān)注[17-18]。

圖1 展青霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Chemical structure diagram of patulin

我國是世界最大的蘋果生產(chǎn)國，2018年蘋果總產(chǎn)量達(dá)到3923.34 噸[19]。近年來隨著蘋果產(chǎn)量的增加，我國蘋果濃縮汁加工業(yè)也得到了迅速的發(fā)展，在蘋果汁的生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的蘋果渣，每年我國有超過300萬噸蘋果渣產(chǎn)生[20]，這些蘋果渣處理不當(dāng)，不僅會造成資源浪費(fèi)，還會造成環(huán)境污染。蘋果渣中纖維素含量較高而蛋白質(zhì)含量較低，若將其直接作為動物飼料，容易帶來動物的營養(yǎng)不良、腹瀉等問題[21-22]。蘋果渣含有較高的水分，極易被微生物侵染。擴(kuò)展青霉是蘋果及其制品的主要污染微生物，其污染會產(chǎn)生大量展青霉素[23]。目前我國并未對飼料原料中的展青霉素做出明確的限量標(biāo)準(zhǔn)，大多養(yǎng)殖場在使用蘋果渣做為飼料時并未對其真菌毒素進(jìn)行檢測，這為蘋果渣的資源化應(yīng)用帶來了很大的風(fēng)險。

目前，利用微生物發(fā)酵蘋果渣的研究在國內(nèi)外已有一些報道[24]，大多數(shù)研究是為了改善蘋果渣中的蛋白質(zhì)含量，使其更適用于動物飼料[25]。關(guān)于微生物發(fā)酵法脫除蘋果渣中展青霉素污染的研究未見報道。發(fā)酵菌株黑曲霉FS10是本課題組從發(fā)酵醬油醅中篩選而得[26]，已被證明是食品級安全菌株，在過去的研究中該菌株顯示出對多種真菌毒素優(yōu)異的降解能力[27-28]。本研究使用黑曲霉FS10菌株生物發(fā)酵展青霉素污染的蘋果渣，采用響應(yīng)面法對比不同條件下發(fā)酵前后展青霉素的降解率變化，篩選出最優(yōu)的發(fā)酵參數(shù)，并對最佳發(fā)酵參數(shù)下蘋果渣中營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行評價。該研究目的旨在為蘋果渣資源化利用的提供新思路，并為研發(fā)一種安全富有營養(yǎng)的蘋果渣飼料提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 本課題篩選并保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC M2013703；展青霉素污染的蘋果渣(烘干) 隨機(jī)采購于江蘇省十家養(yǎng)殖場，經(jīng)檢測所采購樣品均存在較高的展青霉素污染(2.61～11.37 mg/kg)，選取污染最嚴(yán)重的樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥98%，美國GLPBIO公司；乙腈、乙酸乙酯 色譜純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基) 上海博微生物科技有限公司。

Agilent 1260 HPLC 系統(tǒng) 美國安捷倫公司；VB-40立式高溫高壓滅菌鍋 德國SYSTEC；BSC-1300超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SX2-5-12N馬弗爐 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；K9840自動凱氏定氮儀、SOX406脂肪測定儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司；THZ-D臺式恒溫振蕩器 上海百典儀器設(shè)備有限公司；EX-OHOUS電子天平、旋渦振蕩儀 美國奧豪斯公司；Scientz-10N臺式冷凍干燥機(jī)、Scientz-10LS真空離心濃縮儀、SB-5200DT超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Eppendorf離心機(jī) 德國艾本德公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑曲霉FS10菌株活化及孢子懸浮液制備 將黑曲霉FS10接種于PDA固體培養(yǎng)基28 oC培養(yǎng)5 d后用含0.05%吐溫-80的無菌生理鹽水將孢子洗下，調(diào)整孢子濃度為106CFU/mL，作為FS10孢子懸液備用。

1.2.2 蘋果渣生物發(fā)酵處理 將蘋果渣粉碎，過30目篩后混合均勻收集蘋果渣備用。利用GB/T 14699.1-2005的采樣方法對粉碎后蘋果渣進(jìn)行采樣稱重后分裝于50 mL三角錐形瓶中，使用封口膜封口，進(jìn)行121 ℃、20 min滅菌處理。

將滅菌處理過的蘋果轉(zhuǎn)移至發(fā)酵容器中，加入無菌水至一定料水比(蘋果渣質(zhì)量與無菌水體積的比值，g/mL)，加入FS10孢子懸浮液至一定接種量(菌液體積與蘋果渣質(zhì)量的百分比)，攪拌均勻后于一定溫度下進(jìn)行恒溫有氧發(fā)酵，分別在發(fā)酵后一定時間取樣。

1.2.3 蘋果渣中展青霉素及營養(yǎng)指標(biāo)含量的測定 參考GB5009.185-2016對蘋果渣中展青霉素進(jìn)行提取和濃度測定；參考GB/T 6432-2018對蘋果渣中粗蛋白進(jìn)行檢測；參考GB/T 6434-2006對蘋果渣中粗纖維素進(jìn)行檢測；參考GB/T 6433-2006對蘋果渣中粗脂肪進(jìn)行檢測；參考GB/T 18246-2019對蘋果渣中氨基酸進(jìn)行檢測；參考GB/T 6438-2007對蘋果渣中灰分物質(zhì)進(jìn)行測定。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以展青霉素脫除率為指標(biāo)，控制孢子懸浮液濃度為106CFU/mL，分別對接種量1%、5%、10%、15%、20%，料水比 1∶3(g/mL)，培養(yǎng)溫度30 oC，發(fā)酵時間3 d；發(fā)酵溫度20、25、30、35、40 oC，料水比 1∶3，接種量 10 %，發(fā)酵時間3 d；發(fā)酵時間1、2、3、4、5 d，料水比1∶3(g/mL)，接種量10%，培養(yǎng)溫度30 oC；料水比1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5、1∶4 g/mL，接種量10%，培養(yǎng)溫度30 ℃，發(fā)酵時間4 d。分別對4個因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定各因素對展青霉素降解效率的影響。

展青霉素降解率計(jì)算方法為：展青霉素降解率(%)=(未發(fā)酵樣品中展青霉素含量 - 發(fā)酵后樣品中展青霉素含量)/未發(fā)酵樣品中展青霉素含量 × 100

1.2.5 響應(yīng)面法因素水平設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert11軟件應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，選擇接種量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時間(C)、料水比(D)作為響應(yīng)變量，以展青霉素降解率作為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 26、GraphPad Prism 8、Design Expert 11軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析及圖像繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 接種量對展青霉素脫除的影響 不同接種量對于黑曲霉脫除蘋果渣中的展青霉素有著重要影響，接種量過小或過大均不利于發(fā)酵的進(jìn)行。圖2表示不同接種量對展青霉素降解率的影響，在接種量為10%時，展青霉素的降解率最高，在接種量為1%～10%時展青霉素降解率隨著接種量增加而升高，接種量為15%時，展青霉素降解率明顯下降，這可能是發(fā)酵體系中的營養(yǎng)物質(zhì)有限，接種量過大造成微生物之間生存競爭加大，從而導(dǎo)致微生物的生長受到抑制，所以選擇10%的接種量最為適宜。

圖2 接種量對黑曲霉脫除展青霉素的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the removal of patulin by Aspergillus niger

2.1.2 發(fā)酵溫度對展青霉素脫除的影響 不同發(fā)酵溫度會對發(fā)酵微生物生理活性產(chǎn)生極大的影響，且對同一發(fā)酵微生物而言，菌最適生長溫度與最適發(fā)酵的溫度并不一定相同，故需要對黑曲霉降解蘋果渣中展青霉素的最適發(fā)酵溫度進(jìn)行探究。由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，蘋果渣中展青霉素的降解速率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)溫度為30 ℃時展青霉素降解率達(dá)到最高，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時，降解率迅速降低。這可能是由于每種微生物都有比較適合生長和發(fā)酵的溫度，溫度過低微生物的生長繁殖變慢，而溫度過高會導(dǎo)致微生物內(nèi)的酶活降低，影響其正常的生長，因此選擇30 ℃的發(fā)酵溫度最為適宜。

圖3 發(fā)酵溫度對黑曲霉脫除展青霉素的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the removal of patulin by Aspergillus niger

2.1.3 發(fā)酵時間對展青霉素脫除的影響 發(fā)酵時間是發(fā)酵過程中的重要參數(shù)之一，由圖4可得，展青霉素降解率隨時間的延長而升高，在發(fā)酵時間為3～5 d后基本保持穩(wěn)定。參考劉倩男[29]研究，發(fā)酵蘋果渣多用于動物飼料使用，需要發(fā)酵過程豐富其中蛋白含量，且發(fā)酵時間過長黑曲霉會產(chǎn)生大量的黑色菌絲，影響發(fā)酵物的感官品質(zhì)。因此本研究選擇發(fā)酵時間4 d為最佳發(fā)酵時間。

圖4 發(fā)酵時間對黑曲霉脫除展青霉素的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the removal of patulin by Aspergillus niger

2.1.4 料水比對展青霉素脫除的影響 發(fā)酵體系中的水分含量在微生物發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用，如圖5可知，隨著料水比的增大，蘋果渣中展青霉素的降解率呈先升高后穩(wěn)定的趨勢，水分含量較低時微生物的活性較弱，隨著水分含量的增加微生物的生理活性也隨之增加，當(dāng)水分含量滿足微生物需求時，其對微生物的生長影響不大。當(dāng)料水比為1∶3時展青霉素降解率達(dá)到最大值，故選取1∶3作為蘋果渣中展青霉素的最適發(fā)酵料水比。

圖5 料水比對黑曲霉脫除展青霉素的影響Fig.5 Effect of ratio of material to water on the removal of patulin by Aspergillus niger

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平 為了得到黑曲霉發(fā)酵脫除蘋果渣中展青霉素的最適參數(shù)，根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)得到的較優(yōu)發(fā)酵參數(shù)，采用響應(yīng)面法對接種量、料水比、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度四個因素兩兩交互影響進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定黑曲霉生物發(fā)酵脫除蘋果渣中展青霉素的四個單因素參數(shù)適宜范圍，選取展青霉素降解率為考察指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 通過Design Expert 11對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合及方差分析，得到以展青霉素降解率(Y)為響應(yīng)值，接種量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時間(C)、料水比(D)的二次多項(xiàng)回歸模型：

為檢驗(yàn)回歸模型的有效性，對回歸模型進(jìn)行方差和顯著性分析，見表3。

結(jié)果表明，回歸模型極顯著(P<0.001)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，R2adj為0.8459，表明該模型有較好的擬合性，該回歸模型可用于預(yù)測分析且能較好地反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。由表3可知，蘋果渣中展青霉素降解率的影響因素主次順序?yàn)榘l(fā)酵溫度>料水比>發(fā)酵時間>接種量。

表3 展青霉素降解率回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of patulin degradation rate regression model

2.2.3 各因素兩兩交互作用 如圖6所示，影響黑曲霉發(fā)酵蘋果渣的4個因素(接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和料水比)兩兩因素交互作用的響應(yīng)面圖，結(jié)合表3結(jié)果，交互項(xiàng)AB、AC、AD、BC、BD、CD對試驗(yàn)結(jié)果的顯著性分析均為P>0.05，表明接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和料水比這4 個因素的兩兩交互作用不顯著。上述回歸模型的最佳值存在響應(yīng)面最高點(diǎn)，等高線圖的圓心，即展青霉素降解率最大時的穩(wěn)定點(diǎn)，與之對應(yīng)的因素水平即為最佳工藝條件[30]。

2.2.4 響應(yīng)面最優(yōu)條件的確定 運(yùn)用Design Expert 11 軟件分析得最優(yōu)脫除展青霉素的參數(shù)為接種量9.54%，發(fā)酵溫度31.25 oC，發(fā)酵時間3.91 d，料水比1∶3.24。此條件下預(yù)測的展青霉素降解率為98.33%。鑒于實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作的可行性，選取接種量10%，發(fā)酵溫度31 oC，發(fā)酵時間4 d，料水比1∶3.2，在此條件下進(jìn)行黑曲霉生物發(fā)酵蘋果渣實(shí)驗(yàn)，設(shè)置3個平行，得到展青霉素均降解至檢出限以下(6 μg/kg)，降解率為100%，與理論值相對誤差為1.67%，說明該優(yōu)化參數(shù)可行，具有實(shí)際應(yīng)用價值。

2.3 最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)下蘋果渣中營養(yǎng)物質(zhì)評價

在展青霉素降解的最佳條件下，對發(fā)酵前后蘋果渣中粗蛋白、粗脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行研究。以干物質(zhì)為基礎(chǔ)，與發(fā)酵前蘋果渣相比，發(fā)酵后的蘋果渣中粗纖維含量從20.26%降低17.32%；粗蛋白含量從 8.16% 提高至 10.08%；粗脂肪含量從3.32%提高至4.06%；粗灰分從3.34%提高至4.76%；總氨基酸含量從發(fā)酵前的64.43 mg/g提高至73.78 mg/g(表4、表5)。表明黑曲霉FS10可以利用蘋果渣中殘余的營養(yǎng)物質(zhì)，降解蘋果渣中的纖維素并合成蛋白質(zhì)，同時氨基酸含量也顯著提高。氨基酸能夠增強(qiáng)動物的免疫力，增進(jìn)動物食欲，促進(jìn)動物生長發(fā)育等作用。該方法不僅能對污染蘋果渣進(jìn)行解毒脫毒，還能獲得微生物發(fā)酵過程中的氨基酸、蛋白質(zhì)等中間代謝產(chǎn)物，符合發(fā)酵飼料的菌種篩選條件[31]，為污染蘋果渣的資源化利用提供了新的思路。

3 結(jié)論

本研究利用黑曲霉FS10生物發(fā)酵蘋果渣，研究了接種量、料水比、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度四個因素對蘋果渣中展青霉素降解效果的影響，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化上述四個條件對展青霉素的降解效果，研究結(jié)果表明在接種量10%，發(fā)酵溫度31 oC，發(fā)酵時間4 d，料水比1∶3.2的條件下進(jìn)行黑曲霉生物發(fā)酵展青霉素污染的蘋果渣，通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)該黑曲霉菌株對展青霉素的脫除有著明顯的效果，可將其降解至檢出限以下(6 μg/kg)，即發(fā)酵后蘋果渣中的展青霉素完全被降解。

有研究表明黑曲霉發(fā)酵可用于開發(fā)蘋果渣蛋白飼料，減少動物直接使用蘋果渣飼料時造成的營養(yǎng)不良[29]。本研究對展青霉素降解最優(yōu)條件下發(fā)酵后蘋果渣的基本物質(zhì)進(jìn)行測定。結(jié)果表明，發(fā)酵后的蘋果渣中粗纖維含量從20.26%降低17.32%；粗蛋白含量從 8.16% 提高至 10.08%；粗脂肪含量從3.32%提高至4.06%；粗灰分從3.34%提高至4.76%；總氨基酸含量從發(fā)酵前的64.43 mg/g提高至73.78 mg/g。因此，黑曲霉FS10發(fā)酵展青霉素污染的蘋果渣，不僅能完全脫除蘋果渣中的展青霉素，還能改善蘋果渣為原料的飼料中蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)含量較低的問題，并為安全、富有營養(yǎng)的蘋果渣飼料加工提供了有力的技術(shù)參考。此外，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，更好地提高發(fā)酵后蘋果渣中蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的含量，以及探究發(fā)酵蘋果渣飼料對動物生長發(fā)育的影響將是今后研究的重點(diǎn)。

圖6 各因素交互作用對展青霉素降解率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots of the interaction of various factors on the removal rate of patulin

表4 黑曲霉固態(tài)后發(fā)酵蘋果渣基本成分的變化(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 4 Effect of Aspergillus niger fermentation on nutrients composition of apple pomace( DM basis)

表5 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵蘋果渣后氨基酸成分的變化(干物質(zhì))Table 5 Effect of Aspergillus niger fermentation on amino acid composition of apple pomace (DM basis)