6-芐基腺嘌呤人工抗原的合成及鼠源多克隆抗體的制備

孟繼秋，胡驍飛，王 耀，邢云瑞，曹金博，陳琳琳，孫亞寧，張改平,3

(1.河南省農業(yè)科學院 動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002； 2.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003； 3.河南農業(yè)大學，河南 鄭州 450002)

6-芐基腺嘌呤(6-benzylaminopurine,6-BA)是第一個人工合成的廣泛應用于植物生長培養(yǎng)基的細胞分裂素[1]，在植物體內通常以核糖加合物6-BAR的形式存在[2]，6-BA分子式為C12H11N5，6-BA與6-BAR的結構式如圖1所示。6-BA難溶于水，微溶于乙醇，在酸、堿中穩(wěn)定。6-BA具有抑制植物葉綠素、核酸、蛋白質的分解，并能將氨基酸、生長素、無機鹽等向處理部位調運等多種效能而被廣泛使用于植物生長的各個環(huán)節(jié)[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，6-BA具有縮短豆芽生長周期、促進莖的生長和抑制生根的作用而被濫用于豆芽生產中[4]。然而大量的研究結果顯示，6-BA在豆芽內不易代謝，而且商家為了牟取暴利經(jīng)常過量添加導致其在豆芽中殘留，人食用含有6-BA的豆芽會造成生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，還會導致性早熟[5]，甚至會引起急性中毒和誘發(fā)癌癥[6]。因此，國家食品藥品監(jiān)督管理總局、農業(yè)農村部和國家衛(wèi)生和計劃生育委員會在2015年聯(lián)合發(fā)布公告[7]，嚴禁在豆芽生產過程中使用6-BA。但在利益的驅使下，仍有不法商家在豆芽的生產過程中違法添加6-BA，毒豆芽事件頻發(fā)，對食品安全造成嚴重威脅。

為了防止6-BA在豆芽中的違規(guī)濫用，保證食品安全，科研人員建立了多種檢測6-BA的方法，主要包括高效液相色譜法(High-performance liquid chromatography,HPLC)[8-9]、高效液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用(HPLC-MS)[10-11]、表面增強拉曼光譜法(Surface-enhanced raman spectroscopy,SERS)[12-13]、電化學方法[14]和免疫學檢測方法[15]等。HPLC和SERS具有準確性高、特異性強等特點，但存在儀器昂貴和步驟繁瑣等弊端；電化學方法雖然簡單快速，但其結果受環(huán)境等因素影響，波動較大。相比之下，免疫學檢測方法具有特異性強、靈敏度高等特點，且耗時短、效率高，適用于大批量樣品的快速篩查[16]。目前，免疫學檢測方法已經(jīng)成功應用于2,4-D和赤霉素等植物生長調節(jié)劑的快速檢測[17-18]，有關6-BA的免疫學檢測方法則較少，LI等[19]用碳二亞胺法合成6-BA人工抗原并制備6-BA單克隆抗體，以此抗體建立的膠體金層析試紙檢測限可達到10 μg/L。由于6-BA進入豆芽后會部分代謝成為其核糖加合物6-BAR，可能會影響到檢測的結果，且由于6-BA是小分子物質，屬于半抗原，不具備直接刺激機體產生抗體的能力，必須要與大分子載體蛋白偶聯(lián)制備人工完全抗原。因此，采用高碘酸鹽法將6-BAR與載體蛋白結合制備完全抗原，通過免疫小鼠制備出既可以檢測豆芽中已經(jīng)代謝的6-BAR又可以檢測生產豆芽用水中未被代謝的6-BA多克隆抗體，并對多克隆抗體進行特性鑒定，為建立6-BA的ELISA快速檢測方法奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與溶液 6-BA、6-BAR、弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant,FIA)、羊抗鼠酶標二抗(GaMIgG-HRP)、弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant,FCA)、牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等均購自Gibco公司；高碘酸鈉(Na5IO6)、乙二醇(CH2OH)2購自阿拉丁公司；硼氫化鈉(NaBH4)購自國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為市售分析純，所用緩沖溶液均由本實驗室自行配制。

1.1.2 實驗動物 6周齡BALB/c小鼠購自鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心，由實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.1.3 儀器 Nanodrop One微量核酸蛋白質含量測定儀購自美國Thermo Fisher公司；DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠；ME204E 型電子天平購自德國Mettler Toledo公司；ChemiDocTMXRS+型凝膠成像儀、550型酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原合成 采用高碘酸鹽法[20]制備6-BA人工抗原，合成路線如圖2所示。準確稱取6-BAR標準品4 mg于離心管中，用2 mL甲醇溶解后再加2 mL 稀釋液(pH值為7.4的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，PBS)稀釋至1 g/L，邊攪拌邊向溶液中滴加2 mL濃度為0.01 mol/L高碘酸鈉溶液，將反應液于室溫下攪拌30 min，然后滴加360 μL濃度為0.1 mol/L的乙二醇溶液，室溫下攪拌10 min。準確稱取BSA 16 mg溶于4 mL PBS中，將上述反應液緩慢滴入BSA溶液中，用5%的K2CO3調pH值至9.3，室溫攪拌1 h，每隔30 min滴加1次2 mL質量濃度為1 g/L的硼氫化鈉溶液，共滴加2次，將反應液用0.1 mol/L HCl溶液調pH值至6.5，4 ℃攪拌1 h。最后將反應液移至透析袋中，在4 ℃環(huán)境下以PBS為透析液透析3 d，間隔8 h更換1次透析液，透析結束后即得6-BAR-BSA人工抗原，放入-20 ℃冰箱保存。同方法制備包被抗原6-BAR-OVA。

1.2.2 人工抗原鑒定

1.2.2.1 紫外掃描鑒定 用Nanodrop One微量核酸蛋白質含量測定儀檢測6-BAR-BSA溶液的質量濃度，用PBS配制質量濃度為1 g/L的6-BAR-BSA、BSA、6-BA-OVA、OVA溶液，用甲醇與PBS體積比為1∶1的溶液配制6-BAR標準溶液，以PBS溶液作為空白基線，利用Nanodrop One微量核酸蛋白質濃度測定儀對其在220～320 nm波長進行掃描，根據(jù)最大吸收峰位置變化初步判定偶聯(lián)效果。

1.2.2.2 SDS-PAGE鑒定 參照文獻[21]的方法配制電泳緩沖溶液，濃縮膠體積分數(shù)為5%，分離膠體積分數(shù)為12%，電壓選擇80 V，上樣量為10 μg，進行SDS-PAGE電泳。染色2～3 h，脫色12 h，每4 h更換一次脫色液，通過對比分子質量大小變化判斷偶聯(lián)效果。

1.2.3 6-BA多克隆抗體制備 選擇4只6周齡雌性BALB/c小鼠，首次免疫用無菌PBS將免疫原6-BAR-BSA質量濃度稀釋至500 mg/L，加入等體積FCA，經(jīng)乳化后以每只50 μg的劑量采用背部皮下4點注射方法免疫。后3次免疫用FIA與免疫原等體積混合，其他操作步驟與首免完全相同。免疫間隔21 d。2免后每次免疫后間隔10 d斷尾采血，5 000 r/min離心10 min后取上清凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 6-BA多克隆抗體鑒定

1.2.4.1 包板 用包被液(pH值為9.6的0.05 mol/L的CBS)將包被抗原6-BAR-OVA稀釋至0.5 mg/L，取96孔聚苯乙烯板，每孔加入100 μL稀釋后的包被抗原，放37 ℃恒溫孵育2 h，用PBST(含有0.05% Tween-20的PBS溶液)洗板4次后拍干，每孔加滿封閉液(5%脫脂奶粉溶液)，37 ℃孵育2 h或4 ℃孵育過夜，PBST洗板4次后拍干放4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 6-BA多克隆抗體效價測定 間接ELISA法[22]測定6-BA多克隆抗體效價。取已包被6-BAR-OVA的聚苯乙烯板，每孔加入100 μL PBS鋪底，第1排加入1∶100倍稀釋的小鼠血清后倍比稀釋至倒數(shù)第2排，并設立空白，放37 ℃恒溫孵育15 min；PBST洗板4次后拍干，每孔加入100 μL用封閉液稀釋500倍的GaMIgG-HRP，37 ℃孵育30 min；PBST洗板4次，甩干后每孔加入100 μL顯色液(TMB 磷酸-檸檬酸緩沖液)，顯色10 min后，每孔加100 μL終止液(2 mol/L的硫酸溶液)并讀取OD450值，當OD450值>0.2，且與空白孔OD450值之比>2.1時判定為陽性孔。陽性孔的最高血清稀釋倍數(shù)即為血清效價[23]。

1.2.4.3 6-BA多克隆抗體敏感性鑒定 采用間接競爭ELISA法[24]測定6-BA多克隆抗體敏感性。取已包被6-BAR-OVA的聚苯乙烯板，每孔加入100 μL PBS，將質量濃度為5.12 mg/L的6-BAR標準品溶液或6-BA標準品溶液分別作為游離抗原，倍比稀釋至倒數(shù)第3排，留陽性對照孔和空白孔不加游離抗原而加入100 μL PBS；然后除空白孔外，每孔加入100 μL效價測定時OD450值為1.0左右孔的前一孔所對應稀釋度的多克隆抗體，其他操作步驟與效價測定相同。以抑制率B/B0為縱坐標(其中B為含有不同質量濃度游離抗原各孔的OD450值，B0為不加游離抗原孔的OD450值)，以游離抗原質量濃度的對數(shù)值為橫坐標，繪制抑制曲線，推導線性回歸方程，計算半數(shù)抑制濃度(IC50)，并以IC50值來評定多克隆抗體敏感性。

1.2.4.4 6-BA多克隆抗體特異性鑒定 選擇激動素、赤霉素、4-氯苯氧乙酸鈉、腐霉利、呋喃苯烯酸鈉、BSA、OVA作為競爭物，利用間接競爭ELISA測定多克隆抗體對各競爭物的IC50。以6-BA的IC50與各競爭物的IC50的百分比作為交叉反應率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

6-BA多克隆抗體血清抑制試驗設3組平行，取3組數(shù)據(jù)的平均值用Excel 2016和Graph Pad 8作圖并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 6-BA人工抗原鑒定

2.1.1 6-BA人工抗原質量濃度測定 用Nanodrop One微量核酸蛋白質含量測定儀測得6-BAR-BSA質量濃度為3.0 g/L，6-BAR-OVA質量濃度為3.6 g/L。

2.1.2 紫外掃描 采用高碘酸鹽法制備6-BA人工抗原后，首先利用UV法對人工抗原進行初步鑒定，6-BAR、6-BAR-BSA和BSA紫外掃描圖譜如圖3所示。從圖3可以看出，BSA在278 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，6-BAR在270 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，而6-BAR-BSA的特征吸收峰介于二者之間，初步推測6-BAR和BSA偶聯(lián)成功。圖4為6-BAR、6-BAR-OVA和OVA紫外掃描結果，6-BAR-OVA與OVA和6-BAR的特征吸收峰也不重疊。由此推測，6-BAR和OVA偶聯(lián)成功。

2.1.3 SDS-PAGE鑒定 半抗原與載體蛋白偶聯(lián)后會使蛋白質分子質量變大，從而導致在SDS-PAGE電泳過程中泳動速度變慢。從圖5可以看出，6-BAR-BSA和6-BAR-OVA的泳動速度均小于BSA和OVA，證明6-BAR和與BSA和OVA偶聯(lián)成功。

2.2 6-BA多克隆抗體鑒定

2.2.1 6-BA多克隆抗體效價 在選擇包被質量濃度時主要考慮2個因素，首先是提高靈敏度，其次是節(jié)約包被原。采用棋盤滴定法確定最適包被質量濃度，包被質量濃度依次為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 mg/L，采用間接ELISA法測其OD450值。由圖6可見，包被質量濃度過高時，間接ELISA測定的OD450值并沒有明顯提高，不僅浪費包被原且還會降低間接競爭ELISA的檢測靈敏度。因此，選擇吸光值基本不變的最低包被質量濃度作為最佳包被質量濃度，不但可以大大提高靈敏度，更節(jié)約了檢測成本。當包被質量濃度低于0.5 mg/L時，吸光值明顯降低。因此，選擇最低包被質量濃度0.5 mg/L來測定血清效價以及靈敏度。

由表1可以看出，用6-BAR-BSA免疫小鼠可以刺激機體產生抗體，4免后4只小鼠血清效價均在1∶51 200以上，其中2號小鼠血清效價最高達到1∶204 800?？梢?，制備的人工抗原能刺激小鼠機體產生抗體，6-BA人工抗原合成成功。

2.2.2 6-BA多克隆抗體敏感性 由表2可以看出，4免后6-BA對4只小鼠血清抑制效果明顯，且對2號小鼠血清抑制效果最好，在最適包被質量濃度下，其抑制曲線如圖7所示，線性回歸方程為y=-0.175 1x+0.698 3，R2=0.995 3，且在(IC20～IC80)0.26～701.45 μg/L具有良好的線性關系，IC50為13.48 μg/L。由表3可以看出，6-BAR對4只小鼠血清也均有抑制效果。對2號小鼠血清的抑制曲線如圖8所示，線性回歸方程為y=-0.185 4x+0.732 6，R2=0.993 2，IC50為17.95 μg/L。以上結果表明，本研究制備的多克隆抗體可以與6-BA或其代謝物結合。

表3 6-BA多克隆抗體對6-BA間接競爭ELISA測定結果Tab.3 Indirect competitive ELISA results of 6-BA polyclonal antibody against 6-BA

2.2.3 6-BA多克隆抗體特異性 由表4可知，6-BA與6-BAR的交叉反應率為75.10%，與激動素、赤霉素、4-氯苯氧乙酸鈉、腐霉利、呋喃苯烯酸鈉、BSA、OVA交叉反應率均低于0.01%。交叉反應率越低，則說明特異性越強[25]?？梢姡狙芯恐苽涞?-BA多克隆抗體特異性強。

表4 6-BA多克隆抗體與競爭物的交叉反應Tab.4 The cross-reactivity of 6-BA polyclonal antibody with competimer

3 結論與討論

6-BAR含有鄰二醇結構，可以被高碘酸鹽氧化成為醛基，然后與蛋白質分子中的氨基形成Schiff氏堿[26]，因此本研究采用高碘酸鈉法把6-BAR與載體蛋白進行了偶聯(lián)，相較于LI等[19]采用的碳二亞胺法，這個方法的優(yōu)點是條件溫和，不需要復雜的合成反應，可以在常溫常壓和中性pH值條件下進行。通過免疫小鼠得到高敏感性的多克隆抗體，證明以此方法合成人工抗原可以較好地保證抗原決定簇的完整性。由于6-BAR與6-BA具有相似的結構，其抗原決定簇可能相似。本研究結果表明，用6-BAR制備的多克隆抗體對6-BAR和6-BA都具有較好的敏感性，可以同時檢測生產豆芽用水中的6-BA和豆芽中已經(jīng)代謝的6-BAR。

本研究采用高碘酸鹽法合成6-BAR人工抗原，通過免疫小鼠得到效價在1∶51 200以上的多克隆抗體，2號小鼠血清對6-BA和6-BAR均有較好的敏感性，在0.26～701.45 μg/L時線性關系良好，其檢測6-BA的IC50為13.48 μg/L，對6-BAR的IC50為17.95 μg/L，與激動素、赤霉素、4-氯苯氧乙酸鈉、腐霉利、呋喃苯烯酸鈉、BSA、OVA的交叉反應率在0.01%以下。目前，已報道的高效液相色譜法[8-9]、電化學檢測方法[14]等6-BA儀器檢測方法的檢測限在10 μg/L左右，與本研究結果差距不大。通過細胞融合制備的單克隆抗體靈敏度比相應的多克隆抗體的靈敏度提高10倍甚至更高[25]，因此，以6-BA單克隆抗體建立的免疫學檢測方法相較于傳統(tǒng)的儀器檢測方法不僅會提高檢測速度和降低檢測成本，且在靈敏度上也將具有一定優(yōu)勢。

綜上，本研究采用高碘酸鹽法成功合成了6-BA人工抗原，通過免疫小鼠制備了敏感性好、特異性強的多克隆抗體。