軟骨特異性敲除SIRT1 基因?qū)π∈笞刁w骨質(zhì)疏松的影響及機(jī)制分析*

唐家國 覃松 王凱 鄒凱 何精選 李晨芳 于濱生

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）是絕經(jīng)后婦女和老年人常見的代謝性骨病[1]。骨質(zhì)疏松癥的病理特征包括骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)異常、骨密度降低、骨脆性增加，導(dǎo)致骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加[2]。據(jù)估計(jì)，目前全球約有2 億人患有骨質(zhì)疏松癥，美國約有3400萬患者被診斷患有骨質(zhì)疏松癥或低骨量[3]。骨質(zhì)疏松癥可引起疼痛、脊柱畸形和脆性骨折。脆性骨折通常是由低能量的沖擊造成的，如從站立高度跌落、輕微碰撞或其他常規(guī)的輕傷。在50 歲的婦女中，發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)可能高達(dá)50%[4]。椎體骨折是常見的骨質(zhì)疏松性骨折。椎體骨折可引起長期疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至可增加死亡的風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此，骨質(zhì)疏松癥已成為世界范圍內(nèi)的一個(gè)主要公共健康問題[3]。但是，目前關(guān)于骨質(zhì)疏松癥的治療還沒有金標(biāo)準(zhǔn)。近年來，關(guān)于基因因素對骨質(zhì)疏松的影響研究成為了熱門話題。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是一種Ⅲ型乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，已在哺乳動(dòng)物中得到深入研究。最近的研究確定SIRT1 在代謝疾病、退行性疾病、癌癥和衰老的病理生理學(xué)中起著至關(guān)重要的作用[5]。有研究報(bào)道，SIRT1 基因在骨質(zhì)疏松患者的外周血單核細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)均增高[6]。目前有研究證實(shí)，在前成骨細(xì)胞中特異性敲除SIRT1 基因，對骨松質(zhì)的體積沒有明顯影響，而在成熟的成骨細(xì)胞中特異性敲除SIRT1 基因，則會(huì)導(dǎo)致骨松質(zhì)的體積明顯地減少[7-9]；相反，SIRT1 基因的激活或過表達(dá)，會(huì)出現(xiàn)因年齡增加而導(dǎo)致的骨質(zhì)喪失減少。骨折作為骨質(zhì)疏松最常見的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重椎體骨折可能導(dǎo)致截癱[10]。而手術(shù)是治療骨質(zhì)疏松性骨折的主要方法，雖然像椎體骨質(zhì)疏松性壓縮性骨折手術(shù)治療具有操作簡單、恢復(fù)迅速和手術(shù)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。但是并沒有解決骨質(zhì)疏松性骨折的根本問題[11]。因此，預(yù)防和早期治療骨質(zhì)疏松具有十分重要的臨床意義。

骨質(zhì)疏松癥被廣泛認(rèn)為是一種典型的衰老相關(guān)疾病，而SIRT1 是細(xì)胞生存和壽命的重要調(diào)節(jié)因子[12]。SIRT1 參與了眾多的生物學(xué)過程，包括DNA 修復(fù)、能量代謝、腫瘤抑制和線粒體內(nèi)穩(wěn)定等，成為近年來的研究熱點(diǎn)[13]。有研究表明，SIRT1 基因與骨代謝和骨量關(guān)系密切[14]。

在本研究中，筆者使用Cre-Lox系統(tǒng)對小鼠軟骨中SIRT1基因特異性敲除構(gòu)建（SIRT1 cKO）小鼠，分為SIRT1 基因未敲除與SIRT1 基因敲除的兩組小鼠模型，對兩組小鼠尾椎通過Micro-CT 掃描，對尾椎骨小梁數(shù)量、骨小梁的厚度、骨量體積百分比進(jìn)行量化比較。再采用HE 染色、Masson 染色評價(jià)椎體骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，通過比較兩組小鼠尾椎椎體骨質(zhì)改變情況，從而探討SIRT1 基因?qū)π∈笞刁w骨質(zhì)疏松的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

用Col2a1-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠與SIRTlCO/CO小鼠雜交獲得SIRT1+/+小鼠，兩種小鼠均從美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室購買。實(shí)驗(yàn)中使用的小鼠被安置在北京大學(xué)香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的單獨(dú)通風(fēng)鼠籠中特定的無病原體（specific pathogen free，SPF）屏障區(qū)域，處于12 h 光照/12 h 黑暗周期下，在環(huán)境控制的房間中進(jìn)行常規(guī)通風(fēng)。所有的小鼠都可以自由獲取食物和無菌水。所有實(shí)驗(yàn)程序和小鼠治療均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定進(jìn)行。

1.1.2 主要儀器

高速冷凍離心機(jī)（SIMA 公司，德國），光學(xué)顯微鏡（Leica 公司，德國），PCR 熱循環(huán)儀（Eppendorf 公司，德國），凝膠成像系統(tǒng)Dolphin-DOC（Weahec 公司，美國），包埋切片機(jī)（Skura 公司，日本）。Micro-CT（SCANCO Medical AG 公司，瑞士，CT100，深圳市弗勞恩科技服務(wù)有限公司），ABIPrism 7000 型熒光定量PCR 儀（ABI 公司，美國）。

1.1.3 主要試劑

SIRT1 一抗（Abcam 公司，美國），他莫昔芬、玉米油（Sigma 公司，美國），TRE-trizol（Invitrogen 公司，美國），F(xiàn)astGreen Solution、Safranin OSolution（Scytek 公司，美國），PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBB Premix Ex Tap II（Takara 公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 建立軟骨特異性敲除SIRT1 基因小鼠模型

實(shí)驗(yàn)小鼠的繁殖參考于菲等[15]在利用SIRT1 基因敲除建立小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型的研究中的繁殖方法。通過SIRTlCO/CO小鼠和Col2a1-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠先分別分籠進(jìn)行繁殖，按照1只SIRTlCO/CO雄鼠和1 只SIRTlCO/CO雌鼠合籠、1 只Col2a1-CreERT2雄鼠和1 只Col2a1-CreERT2雌鼠合籠的方式進(jìn)行繁殖。待SIRTlCO/CO小鼠和Col2a1-CreERT2小鼠繁殖到20 只以上，按照1 只SIRTlCO/CO雄鼠與1 只Col2a1-CreERT2雌鼠通過合籠的方式進(jìn)行繁殖得到SIRT1+/+小鼠，SIRT1+/+小鼠繁殖到20只以上時(shí)正常條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至8 個(gè)月齡，然后向SIRT1+/+小鼠腹腔注射他莫昔芬10 mg/mL，75 mg/kg 體重，每日1次，連續(xù)注射5 d，即獲得SIRT1-/-小鼠。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

將14 只Col2a1-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成A 組對照組（SIRT1+/+小鼠組）與B 組敲除組（SIRT1-/-小鼠組），每組7 只，B 組小鼠進(jìn)行上述方法進(jìn)行軟骨特異敲除性SIRT1 基因。同時(shí)對A 組小鼠進(jìn)行等劑量的玉米油腹腔注射。在他莫昔芬注射完畢8 周后，通過頸椎脫臼法處死，留取尾椎（Co5-Co9）標(biāo)本，10%福爾馬林溶液固定后石蠟包埋。

1.2.3 軟骨特異性敲除SIRT1 基因小鼠的基因表型通過熒光定量PCR 反應(yīng)鑒定

通過NCBI 網(wǎng)站GeneBank 查詢SIRT1 基因序列如表1所示，使用Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行引物合成。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 合成。根據(jù)SIRT1 基因的退火溫度選擇三步法完成擴(kuò)增，經(jīng)過44 次循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性依據(jù)溶解曲線判斷，內(nèi)參為GAPDH。以TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II（Perfect Real Time）試劑盒說明作為反應(yīng)參數(shù)，數(shù)據(jù)分析采用Bio-Rad CFX Manager Software1.6 系統(tǒng)及2-Ct的方法進(jìn)行。

表1 軟骨特異性敲除SIRT1 基因小鼠熒光PCR反應(yīng)鑒定的引物

1.2.4 Micro-CT 掃描檢測

將兩組小鼠尾椎標(biāo)本保存于10%福爾馬林溶液中固定24 h，然后整潔擺放在Micro-CT 掃描專用管中，掃描參數(shù)為：55 kV 的峰值電壓，200 A 的電流，11.4 m 的掃描層分辨率，再采用計(jì)算機(jī)軟件對骨小梁數(shù)量、骨小梁的厚度以及骨量體積百分比進(jìn)行定量分析。

1.2.5 骨組織比較

組織標(biāo)本在10%多聚甲醛中固定24 h，脫鈣并石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5 m，行HE 染色和Masson 染色。

1.2.6 免疫組化染色

組織標(biāo)本在10%多聚甲醛中固定24 h，脫鈣并包埋在石蠟中。獲得了連續(xù)的5 m 切片。組織切片在65℃烤箱烘烤3 d，用蒸餾水沖洗2 次，然后進(jìn)行抗原修復(fù)。切片用PBS洗滌3 次，用過氧化物酶阻斷劑處理，再用PBS 洗滌3 次。切片用非免疫動(dòng)物血清處理，然后與SIRT1 抗體一起孵育。切片用PBS 洗滌3 次，然后用二抗孵育。切片用瓊脂溶液處理，然后用兩滴新鮮的瓊脂溶液處理。

1.2.7 免疫組化結(jié)果評定

免疫組化結(jié)果評定參考于斐等的研究[16]，在顯微鏡下，對SIRT1 抗體呈免疫組化陽性的細(xì)胞被染成棕色。將染色強(qiáng)度分為4 級（見表2），以每張切片中所見的陽性細(xì)胞范圍分為5 級（見表3）。每張切片染色積分以兩者乘積表示。評分人員按評分標(biāo)準(zhǔn)均進(jìn)行雙盲評分，數(shù)據(jù)為兩次評估的平均值。

表2 免疫組化染色強(qiáng)度分級表

表3 免疫組化陽性細(xì)胞范圍分級表

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料應(yīng)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t 檢驗(yàn)對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT1 基因敲除的鑒定

剪取兩組小鼠尾尖軟骨組織提取DNA，兩組小鼠基因表型采用熒光定量PCR 反應(yīng)鑒定。結(jié)果顯示A、B 兩組小鼠SIRT1 mRNA 表達(dá)量分別為（8.08±1.64）、（2.61±1.11），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（見圖1）。兩組小鼠SIRT1 表達(dá)趨勢的電泳圖如圖2 所示。證實(shí)B 組小鼠軟骨組織中SITR1 基因敲除成功。

圖1 基因在兩組小鼠中的表達(dá)

圖2 實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠SIRT1 基因表達(dá)的電泳圖

2.2 SIRT1 的免疫組化結(jié)果

SIRT1 抗體在小鼠尾椎椎間盤髓核內(nèi)免疫組化染色積分，A 組為（5.07±2.99）、B 組為（3.10±2.69）。B 組與A 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P＜0.01，見圖3）。

圖3 椎間盤髓核組織免疫組化中SIRT1 的表達(dá)情況（×400）：A.A 組小鼠模型中髓核組織中SIRT1 的表達(dá)情況；B.B 組小鼠模型髓核組織中SIRT1 的表達(dá)情況

2.3 Micro-CT 結(jié)果

兩組小鼠的尾椎標(biāo)本通過Micro-CT 掃描分析得出的骨量體積百分比（Bone volume/Total volume，BV/TV），骨小梁數(shù)目（Trabecular number，Tb.N），骨小梁厚度（Trabecular thickness，Tb.Th）相關(guān)數(shù)據(jù)（見表4）。B 組小鼠骨量體積百分比顯著高于A 組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B 組小鼠骨小梁數(shù)目均顯著高于A 組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖4）；A、B 組小鼠骨小梁厚度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 椎體骨改變情況

Micro-CT掃描后三維重建得出A 組和B 組小鼠的椎體骨改變情況，可以看出B 組小鼠椎體中央或整個(gè)區(qū)域松質(zhì)骨密度較A 組減低，并成蜂窩狀或不規(guī)則片狀低密度改變（見圖5）。

表4 Micro-CT 掃描下兩組小鼠尾椎BV/TV、Tb.N 及Tb.Th 結(jié)果比較（，n=7）

表4 Micro-CT 掃描下兩組小鼠尾椎BV/TV、Tb.N 及Tb.Th 結(jié)果比較（，n=7）

注：A 組為SIRT1 基因未敲除組，B 組為SIRT1 基因敲除組；*與A 組比較，P＜0.05。

圖4 兩組小鼠骨量體積百分比、骨小梁數(shù)目的比較

圖5 MicroCT 三維重建圖：A.A 組小鼠模型的三維重建圖；B.B 組小鼠模型的三維重建圖

2.5 骨組織切片結(jié)果

骨的組織學(xué)切片對比，A 組小鼠椎體骨組織較B 組骨質(zhì)分布更密集（見圖6）。

圖6 兩組小鼠椎體骨組織表現(xiàn)：A.A 組在100 倍鏡下的HE 染色；B.A 組在200 倍鏡下的HE 染色；C.A 組在200 倍鏡下Masson 染色，椎體骨組織均表現(xiàn)為骨小梁變薄、骨間隙增大；D.B 組在100 倍鏡下的HE 染色；E.B 組在200 倍鏡下的HE 染色；F.B 組在200 倍鏡下Masson 染色，均可以顯示A 組小鼠椎體骨組織較B 組骨質(zhì)分布更密集

3 討論

隨著我國逐步進(jìn)入老年性社會(huì)，骨質(zhì)疏松的發(fā)病人數(shù)逐年升高。由于骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨強(qiáng)度降低及骨脆性增加，骨質(zhì)疏松患者極易發(fā)生骨折，嚴(yán)重者可引起患者股骨頭壞死、癱瘓，甚至死亡[17]。而手術(shù)是骨質(zhì)疏松性骨折目前最有效的治療方法，然而骨質(zhì)疏松性骨折患者以老年人居多，術(shù)后的恢復(fù)非常緩慢[18]。同時(shí)，給患者家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。因此，從基因方面治療或者延緩骨質(zhì)疏松的進(jìn)展，以及減少骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生具有十分重要的意義。

有學(xué)者進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)特異性敲除間充質(zhì)干細(xì)胞的SIRT1 基因，可抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨和成軟骨方向分化[7]。而本實(shí)驗(yàn)研究中通過Micro-CT 掃描得到A、B 兩組小鼠的骨量體積百分比、骨小梁數(shù)目和厚度以及三維成像下等數(shù)據(jù)進(jìn)行相互比較，并通過椎體骨組織的HE 染色及Masson 染色進(jìn)行骨組織學(xué)對比，發(fā)現(xiàn)軟骨特異性敲除SIRT1 基因組小鼠導(dǎo)致骨微結(jié)構(gòu)惡化，表現(xiàn)為骨小梁變薄、骨間隙增大和骨密度降低。同時(shí)，筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了上述文獻(xiàn)報(bào)道的SIRT1 基因的敲除導(dǎo)致骨質(zhì)喪失的現(xiàn)象。

近年來，與骨代謝相關(guān)的分子信號通路成為研究熱點(diǎn)。研究表明，與骨質(zhì)疏松相關(guān)的信號通路包括Wnt/ -catenin、RANKL/RANK/OPG、NF-B、PPAR-、PTH、MAPK、pi3k/Akt、Hedgehog 和Notch 信號通路[19]。白藜蘆醇作為SIRT1基因的激動(dòng)劑[20]，目前在研究SIRT1 基因?qū)琴|(zhì)疏松的作用機(jī)制中得到廣泛應(yīng)用。有體外實(shí)驗(yàn)研究[21]報(bào)道，間充質(zhì)干細(xì)胞通過白藜蘆醇處理后會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的成骨向分化。同時(shí)，也有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明[22]，通過藥物激活SIRT1 保護(hù)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和衰老相關(guān)骨質(zhì)疏松癥的小鼠模型的骨質(zhì)疏松癥。經(jīng)SIRT1 激動(dòng)劑治療后，骨量顯著改善。目前，SIRT1 基因激動(dòng)劑白藜蘆醇已用于人體試驗(yàn)，可顯著增加老年肥胖男性的骨量[23]。第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院的研究通過白藜蘆醇對大鼠骨質(zhì)疏松模型的作用機(jī)制研究中證明了藜蘆醇調(diào)節(jié)SIRT1-NF-kB 信號通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，預(yù)防骨質(zhì)疏松癥[24]。近期也有研究報(bào)道，通過白藜蘆醇激活SIRT1/FoxO1 信號通路促進(jìn)小鼠骨質(zhì)疏松模型骨質(zhì)生成，對骨質(zhì)疏松起到保護(hù)作用[25]。本研究中利用特異性敲除軟骨SIRT1 基因，導(dǎo)致小鼠尾椎骨質(zhì)流失增加，可能阻斷或減少了SIRT1 基因?qū)IRT1-NF-kB 信號通路、SIRT1/FoxO1 信號通路及其他骨代謝通路的激活，減少成骨細(xì)胞分化，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的形成。然而，每個(gè)骨代謝的信號通路并不是單獨(dú)存在的，更常見的是多條通路相互交叉共同調(diào)節(jié)骨代謝。也有可能還存在未知、潛在的骨代謝信號通路，這需要我們下一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

然而，這項(xiàng)研究有一定的局限性。骨礦物質(zhì)形成和成骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的。在這項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體內(nèi)研究中，筆者只檢測了SIRT1 基因敲除對小鼠尾椎骨質(zhì)疏松的影響，而沒有研究SIRT1 基因激動(dòng)劑對小鼠骨質(zhì)疏松的影響。另外，筆者未對骨質(zhì)疏松調(diào)節(jié)的分子通路進(jìn)行研究，我們需要進(jìn)一步探索SIRT1 基因?qū)橇空{(diào)的分子機(jī)制。

綜上所述，筆者目前的研究證實(shí)SIRT1 基因?qū)π∈笪沧倒琴|(zhì)疏松具有保護(hù)的作用。這些發(fā)現(xiàn)提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，證明SIRT1 是骨量的積極調(diào)節(jié)者，是開發(fā)骨質(zhì)疏松癥的新療法的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)。