ERR a拮抗劑Compound 29 抑制破骨細(xì)胞改善肥胖引起的骨丟失*

鐘麗紅 盧兆成 黃童齡 楊萌 段銳 管敏

骨是不斷重塑的動(dòng)態(tài)器官，受成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化和活性調(diào)節(jié)。成骨細(xì)胞由間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分化而來(lái)，通過(guò)分泌膠原蛋白和非膠原蛋白組成類骨質(zhì)，并進(jìn)一步鈣化形成新骨；破骨細(xì)胞由造血干細(xì)胞分化而來(lái)，通過(guò)溶解骨基質(zhì)中的有機(jī)成分和無(wú)機(jī)成分發(fā)揮骨吸收功能。成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間的精細(xì)平衡構(gòu)成了骨穩(wěn)態(tài)，骨穩(wěn)態(tài)失衡則可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等常見(jiàn)退行性骨病[1-2]。

肥胖與骨科疾病密切相關(guān)，在一項(xiàng)包含成年男性、絕經(jīng)前和絕經(jīng)后女性的研究中表明，體脂比例與骨質(zhì)疏松和非脊柱性骨折發(fā)生率呈正相關(guān)[3]。臨床數(shù)據(jù)表明超重或患有肥胖癥兒童的骨量低于正常體重兒童[4]，骨折概率高于正常體重兒童[5]，超重或患有肥胖癥成年男性的骨量與體重呈負(fù)相關(guān)[6]。此外，動(dòng)物研究還發(fā)現(xiàn)，高脂飲食（high-fat diet，HFD）引起的肥胖伴隨著過(guò)度的骨吸收[7]。肥胖誘導(dǎo)促炎因子TNF-表達(dá)增加，并通過(guò)其下游信號(hào)通路促進(jìn)破骨分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)破骨形成有激活作用[8-9]；肥胖亦增加核因子B 受體活化因子配體（receptor activator of NF-B ligand，RANKL）/骨保護(hù)素的比率，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[10]。

雌激素相關(guān)受體（Estrogen-related receptor alpha，ERR ）屬于核受體超家族，是一種孤兒核激素受體，參與調(diào)節(jié)線粒體的活性、生物發(fā)生和更新，以及脂質(zhì)分解代謝，在細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮核心作用，是代謝紊亂調(diào)節(jié)的潛在靶標(biāo)[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，ERR 全身性敲除小鼠中可抵抗高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的肥胖[13]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)缺失ERR 基因影響了小腸的脂吸收和脂轉(zhuǎn)運(yùn)[14]。此外，ERR 作為線粒體的關(guān)鍵代謝調(diào)控因子，還調(diào)節(jié)破骨分化過(guò)程中的能量代謝。研究表明，Myc 是破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵決定因素，髓系細(xì)胞特異性敲除Myc 小鼠的破骨細(xì)胞生成減少，通過(guò)代謝學(xué)分析和ChIP 分析發(fā)現(xiàn)，Myc 直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控ERR 介導(dǎo)代謝適應(yīng)，通過(guò)調(diào)節(jié)不同的代謝基因影響破骨細(xì)胞分化，表明Myc/ERR 通路是破骨細(xì)胞氧化代謝的重要調(diào)控通路[15]。另一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)破骨分化過(guò)程中，ERR 與共激活因子PGC-1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)Ndg2、IDH3a、ATP5b 和MCAD 等基因表達(dá)，促進(jìn)線粒體三羧酸循環(huán)并增強(qiáng)線粒體的OXPHOS，證明了ERR 通過(guò)調(diào)控代謝通路影響破骨分化的重要作用[16]。此外，還有研究報(bào)道膽固醇可能是ERR 內(nèi)源性配體，激活ERR 下游氧化代謝相關(guān)通路促進(jìn)破骨形成，進(jìn)一步用ERR 拮抗劑XCT790 則抑制膽固醇誘導(dǎo)的破骨分化[17]。以上研究表明作為線粒體的關(guān)鍵調(diào)控因子ERR 介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過(guò)程中的代謝適應(yīng)，提示靶向ERR 的特異性小分子拮抗劑可抑制破骨形成，ERR 是潛在的骨質(zhì)疏松治療靶點(diǎn)。

糖脂代謝紊亂與骨疾病密切相關(guān)，骨質(zhì)疏松癥被認(rèn)為是糖尿病或肥胖癥并發(fā)癥之一。HFD 引起的肥胖伴隨著過(guò)度的骨吸收，ERR 是骨質(zhì)疏松治療的潛在靶標(biāo)。基于此，筆者構(gòu)建長(zhǎng)期HFD 誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型，對(duì)小鼠進(jìn)行雌激素相關(guān)受體ERR 拮抗劑Compound 29 灌胃給藥，探究Compound 29 對(duì)肥胖小鼠骨量的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)進(jìn)18 只健康的5 周齡C57BL/6J 雄鼠，每籠6 只，飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心。SPF房間室溫保持24℃，每隔12 h 光暗循環(huán)，并按照實(shí)驗(yàn)要求分別用高脂飼料（Research Diets D12492，60 kcal% Fat）或普通飼料飼養(yǎng)，自由攝食與飲水。

1.1.2 主要試劑與儀器

Compound29（#CP-14014122，ChemPartner 公司，上海）、I 型膠原交聯(lián)羧基末端肽（C-terminal telopeptide 1 chain of type Icollagen，CTX-I）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（#CEA665Mu，Cloud-Clone corp 公司，美國(guó)）、血糖儀及血糖試紙（#06870279001，ACCU-CHEK 公司，上海）、福爾馬林組織固定液（益利精細(xì)化學(xué)品公司，北京）、石蠟（Leica 公司，德國(guó)）、乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）（阿拉丁公司，中國(guó)）、乙醇（上凌生物技術(shù)公司，北京）、二甲苯（上凌生物技術(shù)公司，北京）、蘇木素伊紅（Haematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒（# C0105S，碧云天生物技術(shù)公司，上海）、抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistantacidphosphatase，TRAP）染色試劑盒（#387A，Sigma 公司，美國(guó)）、石蠟包埋機(jī)（Leica公司，德國(guó)）、石蠟切片機(jī)（Leica 公司，德國(guó)）、攤片機(jī)（Leica公司，德國(guó)）、烤片機(jī)（Leica 公司，德國(guó)）、光學(xué)正置顯微鏡及相關(guān)成像系統(tǒng)（Olympus 公司，日本）、光學(xué)倒置顯微鏡及相關(guān)成像系統(tǒng)（Olympus 公司，日本）、Skyscan-1176 高分辨率活體Micro-CT（Bruker 公司，德國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 HFD 誘導(dǎo)肥胖雄鼠模型及給藥

5 周齡C57BL/6J 雄鼠正常喂養(yǎng)適應(yīng)1 周后，隨機(jī)分為普通飲食組（CD 組）、高脂飲食組（HFD 組）和“高脂飲食+Compound 29 給藥”組（“HFD+C29”組），每組各6 只。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，HFD 組和“HFD+C29”組小鼠用高脂飼料喂養(yǎng)，CD 組小鼠用普通飼料喂養(yǎng)。18 周后，“HFD+C29”組小鼠每天Compound 29 灌胃給藥，Compound 29 劑量為30 mg/kg 體重，CD 組和HFD 組小鼠等量溶劑灌胃，持續(xù)3 周。

1.2.2 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）

Compound 29 給藥3 周后，進(jìn)行OGTT 實(shí)驗(yàn)。小鼠在實(shí)驗(yàn)前禁食過(guò)夜，葡萄糖灌胃前先稱量體重，再用血糖儀測(cè)量每組小鼠尾靜脈血糖，作為0 點(diǎn)數(shù)據(jù)。按體重進(jìn)行葡萄糖灌胃，葡萄糖劑量為2 g/kg 體重。葡萄糖灌胃后，分別在30、60、120 min 用血糖儀測(cè)量尾靜脈血糖，繪制曲線，分析結(jié)果。

1.2.3 微計(jì)算機(jī)斷層掃描（Micro-CT）與數(shù)據(jù)分析

處死小鼠后，將其放于75%乙醇中浸泡3～5 min。將小鼠鋪于干凈的手術(shù)墊布上，小心分離股骨并去除股骨表面附著的肌肉等軟組織，隨后用10%福爾馬林浸泡固定。固定后股骨標(biāo)本用Skyscan-1176 高分辨率活體Micro-CT 進(jìn)行掃描，并使用NRecon 軟件（NRecon v1.6）和CTAn 軟件（CTAn v1.12）進(jìn)行三維重建和數(shù)據(jù)采集分析。測(cè)量并計(jì)算小鼠骨密度（Bone mineral density，BMD）、相對(duì)骨體積（Bone Volume/Total Volume，BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Trabecular Number，Tb.N）、骨小梁厚度（Trabecular Thickness，Tb.Th）和骨小梁分離度（Trabecular Separation/Spacing，Tb.Sp）。1.2.4 HE 染色和TRAP 染色

固定后的股骨樣品用10%EDTA 脫鈣28 d 后放入包埋盒，流水沖洗去除組織中的脫鈣液后依次置于由低濃度到高濃度乙醇中逐漸脫去組織塊中的水分，再將股骨樣品置于二甲苯中透明，隨后置于已熔化的石蠟中，待石蠟完全浸入后進(jìn)行包埋，凝固后用手動(dòng)切片機(jī)以4 m 的厚度進(jìn)行連續(xù)切片。切片染色前用二甲苯脫蠟，再經(jīng)由高濃度、低濃度乙醇和蒸餾水梯度復(fù)水，隨后進(jìn)行HE 染色和TRAP 染色。通過(guò)Image J分析單位骨小梁周長(zhǎng)破骨細(xì)胞數(shù)（Osteoclast Number/Trabecular Perimeter，OC.N/Tb.Pm）和破骨細(xì)胞周長(zhǎng)百分率（Osteoclast Perimeter/Trabecular Perimeter，OC.Pm/Tb.Pm）。

1.2.5 血漿CTX-I 的定量檢測(cè)

將小鼠血液收集到抗凝管中，離心后取上層血漿，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）對(duì)血漿樣品中的CTX-I 水平進(jìn)行檢測(cè)，分析不同組別小鼠血漿中的CTX-I 濃度。

2 結(jié)果

2.1 HFD 誘導(dǎo)小鼠肥胖

Compound 29 給藥3 周后稱量小鼠體重發(fā)現(xiàn)HFD 組小鼠體重顯著高于CD 組（見(jiàn)圖1A）。處死小鼠后收集附睪旁白色脂肪組織（gonadal white adipose tissue，gWAT）并進(jìn)行稱量，發(fā)現(xiàn)HFD 組小鼠的gWAT 重量顯著高于CD 組（見(jiàn)圖1B）。“HFD+C29”組小鼠的體重和gWAT 重量與HFD組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)圖1）。由此可見(jiàn)經(jīng)過(guò)21 周的高脂喂養(yǎng)后，筆者成功構(gòu)建了肥胖小鼠模型。

圖1 HFD 及Compound 29 灌胃給藥對(duì)小鼠的體重及脂重的影響：A.小鼠體重（Body weight）；B.附睪旁白色脂肪組織重量（gWAT weight）

2.2 ERR 拮抗劑Compound 29 改善肥胖小鼠的糖耐受能力

Compound 29 給藥3 周后測(cè)量小鼠尾靜脈血糖，發(fā)現(xiàn)HFD 組小鼠的血糖升高，而Compound 29 給藥后肥胖小鼠血糖降低（見(jiàn)圖2A）。小鼠禁食過(guò)夜后進(jìn)行OGTT 實(shí)驗(yàn)，葡萄糖灌胃前測(cè)量每組小鼠血糖，作為0 點(diǎn)數(shù)據(jù)，葡萄糖灌胃后分別在30、60、120 min 對(duì)小鼠的血糖進(jìn)行測(cè)量。OGTT曲線顯示HFD組在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖水平均高于CD組，HFD 組OGTT 曲線下面積（area under the curve，AUC）明顯大于CD 組（見(jiàn)圖2B、C）。而Compound 29 給藥后“HFD+C29”組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖水平均低于HFD 組，“HFD+C29”組的OGTT 曲線下面積明顯小于HFD 組（見(jiàn)圖2B、C）。

圖2 Compound 29 對(duì)HFD 小鼠血糖及糖耐受能力的影響：A.小鼠血糖水平；B.OGTT 曲線；C.OGTT 曲線下面積（AUC）

2.3 ERR 拮抗劑Compound 29 改善肥胖小鼠的骨丟失

處死小鼠后，剝離股骨并進(jìn)行固定。用Micro-CT 對(duì)小鼠右股骨掃描重建。結(jié)果顯示：CD 組小鼠骨小梁數(shù)量多，排列緊密并形成網(wǎng)狀；HFD 組小鼠骨小梁數(shù)量減少，排列稀疏紊亂，骨量丟失；而“HFD+C29”組小鼠骨量明顯高于HFD 組小鼠，骨小梁數(shù)量較多，排列較為緊密（見(jiàn)圖3A）。對(duì)采集數(shù)據(jù)進(jìn)行形態(tài)計(jì)量學(xué)動(dòng)態(tài)指標(biāo)分析，結(jié)果可見(jiàn)HFD 組小鼠骨密度（BMD）、相對(duì)骨體積（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）顯著低于CD 組小鼠，而骨小梁分離度（Tb.Sp）則相對(duì)較高；“HFD+C29”組BMD、BV/TV、Tb.N 和Tb.Th 四個(gè)指標(biāo)都顯著高于HFD 組小鼠，而Tb.Sp 則相對(duì)較低（見(jiàn)圖3B-F）。

2.4 ERR 拮抗劑Compound 29 抑制肥胖小鼠的破骨吸收

將小鼠的左股骨用石蠟包埋切片，并進(jìn)行HE 染色和TRAP 染色。小鼠股骨遠(yuǎn)心端HE 染色切片顯示，HFD 組與CD 組小鼠的骨小梁差異明顯。CD 組小鼠骨小梁數(shù)量多且較粗，HFD 組小鼠骨小梁數(shù)量少且較細(xì)，并伴隨大量脂肪空泡，而“HFD+C29”組小鼠骨量顯著高于HFD 組，且脂肪空泡減少（見(jiàn)圖4A）。TRAP 是破骨細(xì)胞特異性酶，染色后破骨細(xì)胞呈紅色。骨切片經(jīng)TRAP 染色后用Image J 進(jìn)行破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)及骨吸收情況分析，結(jié)果顯示與CD 組小鼠相比，HFD 組小鼠單位骨小梁周長(zhǎng)破骨細(xì)胞數(shù)（OC.N/Tb.Pm）增加，破骨細(xì)胞周長(zhǎng)百分率（OC.Pm/Tb.Pm）升高，Compound29給藥后，OC.N/Tb.Pm 減少，OC.Pm/Tb.Pm下降（見(jiàn)圖4B-D）。

CTX-I 是骨吸收的標(biāo)志物，筆者用ELISA 測(cè)定各組小鼠血漿CTX-I 水平，結(jié)果顯示HFD 組小鼠血漿CTX-I 濃度顯著高于CD 組小鼠，Compound 29 給藥后HFD 小鼠血漿CTX-I 濃度降低（見(jiàn)圖5）。

圖3 Compound 29 對(duì)HFD 小鼠骨量的影響：A.各組小鼠股骨Micro-CT 掃描及三維重建結(jié)果圖；B-F.小鼠股骨松質(zhì)骨的二級(jí)微結(jié)構(gòu)定量分析：小鼠骨密度（BMD）（B）、相對(duì)骨體積（BV/TV）（C）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）（D）、骨小梁厚度（Tb.Th）（E）和骨小梁分離度（Tb.Sp）（F）

圖4 Compound 29 對(duì)HFD 小鼠破骨吸收的影響：A.各組小鼠股骨切片遠(yuǎn)心端HE 染色（比例尺：100 m）；B.TRAP 染色（比例尺：100 m），破骨細(xì)胞呈紅色；C、D.骨吸收參數(shù)分析：?jiǎn)挝还切×褐荛L(zhǎng)破骨細(xì)胞數(shù)（OC.N/Tb.Pm）（C）和破骨細(xì)胞周長(zhǎng)百分率（OC.Pm/Tb.Pm）（D）

圖5 Compound29 對(duì)HFD小鼠血漿破骨吸收標(biāo)志物CTX-I水平的影響

3 討論

近年來(lái)，在骨質(zhì)疏松的眾多影響因素中，肥胖與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性越來(lái)越引起人們的關(guān)注，臨床研究與動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)肥胖引起的代謝紊亂往往伴隨著骨質(zhì)疏松[3，7]，本研究構(gòu)建長(zhǎng)期HFD 誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型，與正常小鼠相比，肥胖小鼠的體重和白色脂肪重量顯著增加，同時(shí)伴隨破骨吸收增強(qiáng)并導(dǎo)致骨量減少。

Compound 29 是針對(duì)ERR 與PGC1 的共激活結(jié)構(gòu)域開(kāi)發(fā)的ERR 選擇性拮抗劑，TR-FRET 實(shí)驗(yàn)顯示Compound 29高效抑制ERR 活性（IC50=0.04 M），但是對(duì)同一家族的ERR 的抑制效用卻很低[18]，因此，與傳統(tǒng)的ERR 拮抗劑XCT790 相比，Compound 29 具有更特異的靶向性和較好藥物安全性，適合用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[18]。筆者用Compound29 對(duì)肥胖小鼠進(jìn)行灌胃給藥，結(jié)果顯示肥胖小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量減少，骨吸收減弱，同時(shí)骨密度與骨小梁數(shù)量和厚度增加，表明Compound 29 有效保護(hù)肥胖小鼠骨量。骨切片的HE 染色和TRAP 染色顯示HFD 誘導(dǎo)的肥胖小鼠骨髓腔中有大量的脂肪空泡，而Compound 29 給藥后脂肪空泡減少，表明Compound 29 給藥后減少骨髓脂肪細(xì)胞的累積。此外，有研究表明Compound 29 是一種潛在的降糖化合物[18]，筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Compound 29 灌胃給藥后，肥胖小鼠血糖水平下降，糖耐受能力提高。這些研究提示Compound29 不僅直接作用于破骨形成，也可能通過(guò)調(diào)控小鼠的糖脂代謝間接改善骨穩(wěn)態(tài)失衡。

ERR 在骨形成中的作用尚存在爭(zhēng)議：一方面，有研究發(fā)現(xiàn)大鼠顱蓋成骨細(xì)胞分化過(guò)程中ERR 始終高表達(dá)，體外抑制ERR 的表達(dá)顱蓋成骨細(xì)胞分化減弱[19]，同樣，ERR全身性敲除小鼠中分離的MSCs 體外成骨分化能力減弱[20]；另一方面，也有研究發(fā)現(xiàn)ERR 缺失后小鼠的骨形成增強(qiáng)，股骨骨量增加，能抵抗衰老和雌激素缺乏導(dǎo)致的骨丟失[21]，這些研究表明ERR 的骨形成作用，筆者的研究證實(shí)Compound 29 給藥顯著抑制肥胖小鼠破骨吸收，Compound 29 是否通過(guò)破骨吸收或脂肪因子間接影響骨形成，或是直接作用于成骨細(xì)胞值得進(jìn)一步探索。

綜上，本研究通過(guò)HFD 誘導(dǎo)肥胖雄鼠模型并發(fā)現(xiàn)ERR拮抗劑Compound 29 通過(guò)抑制破骨吸收，改善肥胖雄鼠的骨丟失，為代謝紊亂引起的骨質(zhì)疏松治療提供依據(jù)，同時(shí)本研究證實(shí)了Compound 29 抑制破骨吸收的作用，對(duì)骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)藥物的研發(fā)有一定的參考價(jià)值。