黃柏不同炮制方法對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠藥效的影響

趙洪超 關(guān)書博 王丹

摘要 目的：探究不同炮制方法對黃柏藥效的影響。方法：選擇Balb/c小鼠為實驗動物，將其隨機分為蜜制組、鹽制組、酒制組、生品組與模型組，每組10只，建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，蜜制組、鹽制組、酒制組、生品組給予對應(yīng)藥液灌胃干預(yù)，比較各組疾病活動指數(shù)（DAI）、結(jié)腸長度、結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)、組織學(xué)評分及結(jié)腸組織炎癥介質(zhì)[腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）]、氧化應(yīng)激指標(biāo)[超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）]差異。結(jié)果：其中蜜制組、酒制組DAI及組織學(xué)評分均明顯低于鹽制組、生品組，結(jié)腸組織TNF-α、IL-17水平均明顯低于鹽制組、生品組，結(jié)腸組織IL-10水平均明顯高于鹽制組、生品組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;蜜制組、鹽制組、酒制組結(jié)腸長度及結(jié)腸組織SOD、GSH-Px水平均明顯高于生品組，結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)及結(jié)腸組織MDA水平均明顯低于生品組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：不同方法炮制黃柏均可增強對潰瘍性結(jié)腸炎的藥效，尤以蜜制、酒制黃柏增強效果較為突出，可為其炮制工藝提供參考。

關(guān)鍵詞 黃柏;炮制;藥效;潰瘍性結(jié)腸炎;小鼠;疾病活動指數(shù);結(jié)腸長度;結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù);組織學(xué)評分;炎癥介質(zhì);氧化應(yīng)激指標(biāo)

Effects of Different Processing Methods on Ulcerative Colitis Mice Pharmaceutical Effects of Cortex Phellodendri

ZHAO Hongchao，GUAN Shubo，WANG Dan

（The Second Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110101，China）

Abstract Objective：To explore the effects of different processing methods on pharmaceutical effects of Cortex Phellodendri.Methods：Balb/c mice were selected as experimental animals.And were randomly divided into a ulcerative colitis group，a honey processing group，a salt processing group，a wine processing group，a crude herb group respectively，with 10 mice in each group.The disease activity index （DAI），colon length，colon gross morphological damage index，histological score and colonic cytokines [tumor necrosis factor-α （TNF-α），interleukin-10 （IL-10），interleukin-17 （IL-17）] and oxidative stress indicators [superoxide dismutase （SOD），malondialdehyde （MDA），glutathione peroxidase （GSH-px）] were compared between the 2 groups.Results：The DAI and histological score in honey processing group and wine processing group were significantly lower than those in salt processing group and crude herb group.The levels of TNF-α and IL-17 in colon tissues were significantly lower than those in salt processing group and crude herb group while the level of IL-10 in colon tissues was significantly higher than that in salt processing group and crude herb group （P<0.05）.The colon length and levels of SOD and GSH-px in colon tissues in honey processing group，salt processing group and wine processing group were significantly higher than those in crude herb group，and the colon gross morphological damage index and the MDA level in colon tissues were significantly lower than those in crude herb group （P<0.05）.Conclusion：Different processing methods of Cortex Phellodendri can enhance the pharmaceutical effects of ulcerative colitis，especially the honey-processing and wine-processing Cortex Phellodendri have more prominent enhancement effect，which can provide reference for processing technology.

Keywords Cortex phellodendri; Processing; Pharmaceutical effects; Ulcerative colitis; Mice; Disease activity index; Colon length; Colon gross morphological damage index; Histological score; Cytokines; Oxidative stress indicators

中圖分類號：R282;R574文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.015

黃柏是蕓香科植物黃皮樹的干燥樹皮，常言道“檗木，黃檗也，今處處有之，以蜀中者為佳”，該藥材性寒味苦，歸腎、膀胱經(jīng)，有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡之功效，主治以濕熱瀉痢、熱淋澀痛、瘡瘍腫毒、熱淋澀痛等疾病為代表的熱證[1]。傳統(tǒng)的黃柏炮制方法較多，《證治準(zhǔn)繩》記載“生用降實火，熟用酒制治上，鹽制治下，蜜制治中不傷胃”[2]，可見古代醫(yī)家對黃柏炮制及辨證用藥的經(jīng)驗總結(jié)已較為全面，但未能從藥代動力學(xué)、藥效學(xué)的角度獲得解釋。目前黃柏復(fù)方或組方治療潰瘍性結(jié)腸炎的效果已獲得廣泛證實[3-7]，但黃柏具體如何影響治療效果仍不十分明確。本研究旨在分析不同黃柏炮制藥品治療潰瘍性結(jié)腸炎的療效差異，取得一定成果?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物材料 選擇Balb/c小鼠為實驗動物，均為雄性，周齡為6～8周，體質(zhì)量為18～25 g，隨機分為蜜制組、鹽制組、酒制組、生品組與模型組，每組10只，開展為期1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，確保小鼠自由飲水、攝食，光照周期為12 h光照+12 h黑暗，室溫維持在20～25 ℃。

1.1.2 藥品材料 川黃柏原藥材洗凈后切4 mm絲，取適量置于容器中，蜜制黃柏100 g黃柏絲配30 g蜂蜜+30 g蒸餾水拌勻，悶潤2 h，取出后在120～130 ℃鍋內(nèi)炒制4 min，放涼即得;鹽制黃柏100 g黃柏絲配2 g食鹽+30 g蒸餾水，悶潤2 h，取出后在150～160 ℃鍋內(nèi)炒制6 min，放涼即得;酒制黃柏100 g黃柏絲配20 g黃酒+30 g蒸餾水，悶潤2 h，取出后在150～160 ℃鍋內(nèi)炒制6 min，放涼即得;生品直接以蒸餾水潤透后干燥即得。分別取適量炮制成品，100 g成品加入1 L蒸餾水浸泡30 min，而后以文火煎煮60 min，趁熱過濾保留藥液，藥渣回鍋加入0.8 L蒸餾水，文火煎煮60 min，趁熱過濾，合并2次藥液，濃縮收汁至200 mL備用。

1.2 方法

1.2.1 造模及給藥方法 小鼠飲用2.5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）滅菌水，以0.5%羧甲基纖維素鈉滅菌水灌胃，持續(xù)≥5 d，以疾病活動指數(shù)（DAI）達(dá)到2分作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，隨后蜜制組、鹽制組、酒制組及生品組小鼠給予相應(yīng)藥液灌胃干預(yù)，劑量按體質(zhì)量0.01 mL/g給藥，在此期間各組均飲用不含DSS的滅菌水。

1.2.2 評估方法 試驗完畢后采用DAI評估小鼠病情嚴(yán)重程度[8]，分別從體質(zhì)量下降、大便性狀、便血程度3個方面作出評價，每個方面根據(jù)嚴(yán)重程度計為0～4分，總分/3為最終得分，分?jǐn)?shù)越高表示病情越嚴(yán)重。處死小鼠并解剖采集完整結(jié)腸，測量其長度，以如下標(biāo)準(zhǔn)評估大體損傷表現(xiàn)[9]，0分：無損傷。1分：黏膜略微充血。2分：存在潰瘍且累及<25%受損面積。3分：存在潰瘍且累及25%～50%受損面積。4分：存在潰瘍且累及>50%受損面積。將小鼠結(jié)腸組織常規(guī)固定、脫水、透明化、包埋、切片、染色后進行光鏡下組織學(xué)觀察，并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)提出的評估方法對其組織學(xué)狀態(tài)作出評價[10]，觀察上皮損傷及潰瘍形成、潰瘍深度、淋巴細(xì)胞募集程度、炎性細(xì)胞浸潤深度、中性粒細(xì)胞浸潤深度、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤深度及水腫程度7個方面進行評價，每個方面根據(jù)病變程度計為0～3分，分?jǐn)?shù)越高表示病變越嚴(yán)重。

1.2.3 指標(biāo)檢測方法 準(zhǔn)確切取小鼠結(jié)腸相同部位組織100 mg，加入4 ℃磷酸鹽緩沖液（PBS），組織研磨機勻漿30 s，并在8 000×g加速度下離心10 min，提取上清，分別采用腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）對應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：s160539、s171157、s161204、s180427、s171013、s170635），嚴(yán)格按照說明書操作，測定上述指標(biāo)在上清液中的濃度水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)資料處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間整體比較采用單因素方差分析，對整體比較有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)，實施Student-Newman-Keuls q檢驗進行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAI與結(jié)腸長度比較 各組小鼠DAI與結(jié)腸長度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其中蜜制組、酒制組DAI均明顯低于鹽制組、生品組，且上述4組均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;蜜制組、鹽制組、酒制組結(jié)腸長度均明顯大于生品組，且上述4組均明顯大于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)、組織學(xué)評分比較 各組小鼠結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)、組織學(xué)評分比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其中蜜制組、鹽制組、酒制組結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)均明顯低于生品組，且上述4組均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;蜜制組、酒制組組織學(xué)評分均明顯低于鹽制組、生品組，且上述4組均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 結(jié)腸組織炎癥介質(zhì)比較 各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-10、IL-17水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其中蜜制組、酒制組結(jié)腸組織TNF-α、IL-17水平均明顯低于鹽制組、生品組，且上述4組均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其中蜜制組、酒制組結(jié)腸組織IL-10水平均明顯高于鹽制組、生品組，且上述4組均明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.4 結(jié)腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 各組小鼠結(jié)腸組織SOD、MDA、GSH-Px水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其中蜜制組、鹽制組、酒制組結(jié)腸組織SOD、GSH-Px水平均明顯高于生品組，且上述4組均明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;蜜制組、鹽制組、酒制組結(jié)腸組織MDA水平均明顯低于生品組，且上述4組均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎多由過食寒涼、嗜食辛辣、暴飲暴食等飲食不節(jié)行為引起脾臟失于運化所致[11]，氣血生化乏源而濕濁內(nèi)生熱化，腸胃怫郁，濕勝濡瀉，氣血與濕熱搏結(jié)，化為膿血黏液，氣液宣通不能，故濕熱蘊阻腸腑而為病。黃柏治療潰瘍性結(jié)腸炎能控制急性發(fā)作，緩解臨床癥狀，并減少復(fù)發(fā)[12]，其復(fù)方水煎劑保留灌腸效果尤其確切，可起清熱健脾、化濕止痢之效，但需嚴(yán)格把控用藥劑量、藥液濃度與溫度[13]。本研究結(jié)果顯示，蜜制組、鹽制組、酒制組、生品組小鼠DAI及結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)、組織學(xué)評分均比模型組更低，結(jié)腸長度則比模型組更高，這表明黃柏炮制成品及生品治療小鼠潰瘍性結(jié)腸炎效果均屬良好。其中蜜制、酒制黃柏療效較為突出，鹽制黃柏與生品黃柏次之，究其原因可能與不同炮制方法可改變黃柏內(nèi)有效化學(xué)成分保留情況，以及用藥后在小鼠體內(nèi)分布、吸收、代謝、廓清等產(chǎn)生較大影響有關(guān)。

生黃柏具有苦寒之性，清熱燥濕作用強，藥性猛烈而易使氣血下沉，瀉火效果極佳;蜂蜜常用于調(diào)補脾胃、扶正養(yǎng)陰，蜜制法可保護胃腑不受黃柏寒性所傷，可治療中焦熱病[14];黃酒作為常用藥引，乙醇含量適中且性質(zhì)溫和，充分溶解藥材的有效疏水性成分，提高藥物效能，并令藥性上體，酒制黃柏常用于治療上焦熱病[15];而《藥品辨義》有云“用咸水炒，使咸入腎，主降陰火，救腎水”，可見鹽制黃柏使其苦寒之性進一步增強，又引藥下行入腎，增強滋陰降火之功，可主治下焦熱病[16]。現(xiàn)代藥理研究顯示，黃柏有效成分包括小檗堿、小檗紅堿、黃柏堿、檸檬苦素、黃柏酮及木蘭花堿[17-19]，其中尤以小檗堿對腸道組織作用最為明顯，可促進潰瘍愈合、保護黏膜屏障、抑制炎癥反應(yīng)、維持菌群平衡并增強腸管張力與蠕動幅度[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，蜜制組與酒制組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-17水平明顯低于鹽制組與生品組，而IL-10水平則明顯高于鹽制組與生品組，提示蜜制或酒制黃柏相較于鹽制黃柏或生品黃柏能對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠產(chǎn)生更為強效的炎癥反應(yīng)抑制作用。相關(guān)專家提出，雙酯類生物堿及醇胺類生物堿在體內(nèi)轉(zhuǎn)化效率相對單酯類生物堿更慢，混入蜂蜜后，肝臟代謝易于達(dá)到飽和，生物堿在通過門靜脈進入肝臟時速度減緩，生物堿可在循環(huán)系統(tǒng)中停留更長時間，有助于產(chǎn)生持久藥效[21]。本研究還發(fā)現(xiàn)，蜜制組、鹽制組、酒制組的結(jié)腸組織SOD、GSH-Px水平顯著較生品組更高，而結(jié)腸組織MDA水平則顯著較生存組更低，這說明炮制可增強黃柏抗氧化應(yīng)激作用。但不同炮制方法增強效果差異不大，初步分析認(rèn)為，酒制黃柏盡管提高小檗紅堿在局部組織的分布，但由于肝腸循環(huán)的存在，可導(dǎo)致鹽制黃柏小檗紅堿藥時曲線呈現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，因此二者綜合作用下，并不對DSS誘發(fā)的潰瘍性結(jié)腸炎局部氧化反應(yīng)失衡的黃柏藥液灌胃治療效果增強產(chǎn)生影響。

綜上所述，蜜制、鹽制、酒制黃柏與生品黃柏均能有效恢復(fù)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度，并逆轉(zhuǎn)結(jié)腸大體損傷，抑制局部氧化應(yīng)激反應(yīng)，其中蜜制、酒制黃柏改善小鼠癥狀表現(xiàn)、病變程度及炎癥介質(zhì)表達(dá)效果較為理想，炮制藥材與臨床用藥可以此為據(jù)開展相關(guān)工作。

參考文獻(xiàn)

[1]朱培霞，易成文，周翠.蒼術(shù)黃柏藥配伍規(guī)律對藥效物質(zhì)的影響[J].世界中醫(yī)藥，2018，13（7）：1766-1769.

[2]張凡，周遠(yuǎn)征，趙遠(yuǎn)，等.HPLC異硫氰酸苯酯柱前衍生化測定黃柏及其不同炮制品中17種氨基酸的含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2017，35（9）：2259-2262.

[3]鄧臺燕，全大祥，吳彬.復(fù)方黃柏液聯(lián)合美沙拉嗪對潰瘍性結(jié)腸炎及腸道菌群和血清炎癥因子的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2016，26（9）：124-127.

[4]李輝標(biāo)，陳新林，陳慕媛，等.復(fù)方黃柏液聯(lián)合化學(xué)藥治療潰瘍性結(jié)腸炎的Meta分析[J].中國藥房，2017，28（30）：4229-4232.

[5]朱磊，沈洪，王玖，等.基于無尺度網(wǎng)絡(luò)下的潰瘍性結(jié)腸炎灌腸中藥探析[J].遼寧中醫(yī)雜志，2016，43（9）：1940-1943.

[6]Zhu L，Gu P，Shen H.Protective effects of berberine hydrochloride on DSS-induced ulcerative colitis in rats[J].Int Immunopharmacol，2019，68：242-251.

[7]Chen YY，Li RY，Shi MJ，et al.Demethyleneberberine alleviates inflammatory bowel disease in mice through regulating NF-κB signaling and T-helper cell homeostasis[J].Inflamm Res，2017，66（2）：187-196.

[8]謝艷，魏兵，歐陽欽.疾病活動指數(shù)在炎癥性腸病診治中的應(yīng)用[J].中華消化雜志，2001，21（9）：559-560.

[9]林燕，李文靜，常孟然，等.益氣解毒方對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠慢性期結(jié)腸炎性反應(yīng)遠(yuǎn)期療效的觀察[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（12）：5302-5306.

[10]李陽，郝藝照，傅熠俊，等.黃連素預(yù)防葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（8）：3431-3435.

[11]李鵬帆，羅月，張玉麗，等.苦參及其復(fù)方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制研究進展[J].世界中醫(yī)藥，2020，16（6）：945-948.

[12]Wang L，Wang X，Zhu XM，et al.Gastroprotective Effect of Alkaloids from Cortex Phellodendri on Gastric Ulcers in Rats through Neurohumoral Regulation[J].Planta Med，2017，83（3-04）：277-284.

[13]齊雪陽，張勤生，張春燕.芍藥湯加減保留灌腸聯(lián)合美沙拉嗪腸溶片治療大腸濕熱證潰瘍性結(jié)腸炎[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2016，22（19）：149-153.

[14]Lei X，Shan G，Zhang F，et al.Determination and comparison of alkaloids and triterpenes among tissues after oral administration of crude and processed Phellodendri Chinensis Cortex by UPLC-QqQ-MS[J].Nat Prod Res，2020，34（9）：1337-1340.

[15]陳悅，李玲，張壤丹，等.酒黃柏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2016，27（6）：1371-1373.

[16]王淑慧，鄧哲，章軍，等.黃柏飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國中藥雜志，2018，43（5）：873-878.

[17]邢宇，劉鑫，林園，等.小檗堿藥理作用及其臨床應(yīng)用研究進展[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2017，31（6）：491-502.

[18]Zhou Z，Lin Y，Gao L，et al.Circadian pharmacological effects of berberine on chronic colitis in mice：Role of the clock component Rev-erbα[J].Biochem Pharmacol，2020，172：113773.

[19]Jing W，Safarpour Y，Zhang T，et al.Berberine Upregulates P-Glycoprotein in Human Caco-2 Cells and in an Experimental Model of Colitis in the Rat via Activation of Nrf2-Dependent Mechanisms[J].J Pharmacol Exp Ther，2018，366（2）：332-340.

[20]張龍，史明星，劉金鳳，等.小檗堿衍生物的合成及其藥理活性研究進展[J].國際藥學(xué)研究雜志，2018，45（5）：325-332.

[21]Cao X，Sun L，Li D，et al.Quality Evaluation of Phellodendri Chinensis Cortex by Fingerprint Chemical Pattern Recognition[J].Molecules，2018，23（9）：2307.

（2019-07-31收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）