基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討清肺化痰方改善慢性阻塞性肺疾病的作用機制

薛艷 許嘉慧 高艷榮 陳飛飛 孫仕奇 張煒

摘要 目的：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探究清肺化痰方改善慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）氣道黏液高分泌的有效成分和潛在分子機制。方法：首先使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）收集清肺化痰方的活性成分和潛在靶點，利用GeneGards等多個數(shù)據(jù)庫篩選AECOPD氣道黏液高分泌的疾病靶點;然后將疾病靶點與藥物預(yù)測靶點取交集，借助Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建交集靶點網(wǎng)絡(luò)以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，利用DAVID進行GO和KEGG富集分析。最后，將藥物活性成分與疾病靶點進行分子對接。結(jié)果：清肺化痰方中54個有效活性成分可通過67個潛在靶標(biāo)改善AECOPD的氣道黏液高分泌，涉及TNF信號通路、IL-17、PI3K-Akt等相關(guān)信號通路。槲皮素、木犀草苷、β-谷甾醇等成分與AKT1、IL6、EGF等靶標(biāo)蛋白結(jié)合穩(wěn)定。結(jié)論：初步揭示清肺化痰方可直接改善AECOPD氣道黏液高分泌，以及其多靶點、多通路的潛在作用機制，為后續(xù)研究提供思路。

關(guān)鍵詞 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接;氣道黏液高分泌;慢性阻塞性肺疾病急性加重期;清肺化痰方

Exploring the Mechanism of Therapeutic Effect of Qingfei Huatan Decoction on Chronic Obstructive Pulmonary Disease Based on Network Pharmacology

XUE Yan1，XU Jiahui2，GAO Yanrong1，CHENG Feifei1，SUN Shiqi1，ZHANG Wei1

（1 Department of Respiratory Diseases，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China; 2 Department of Endocrinology，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China）

Abstract Objective：To explore the potential active components and underlying molecular mechanisms of Qingfei Huatan Decoction to improve the hypersecretion of airway mucus in acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease（AECOPD）through the network pharmacology and molecular docking technology.Methods：First，the active components and potential targets of Qingfei Huatan Decoction were collected through the traditional Chinese medicine system pharmacology analysis platform（TCMSP），and the targets related to airway mucus hypersecretion in AECOPD were screened by GeneCards database.Then，the disease target and the drug prediction target were intersected，and the intersection target network and protein interaction network were constructed with the help of Cytoscape 3.7.2 software，and the GO and KEGG enrichment analysis were performed by DAVID.Finally，the active ingredient of the drug was molecularly docked with the disease target.Results：A total of 54 effective active ingredients of Qingfei Huatan Decoction were obtained，which could act on AECOPD airway mucus hypersecretion through 67 potential targets，involving TNF signaling pathway，IL-17，epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors resistance，PI3K-Akt，HIF-1，MAPK and other related signaling pathways.Molecular docking results showed that quercetin，luteolin，beta-sitosterol and other pharmaceutical active ingredients could bind to AKT1，IL6，EGF and other target proteins stably.Conclusion：The molecular docking technique reveals that Qingfei Huatan Decoction can directly improve the airway mucus hypersecretion of AECOPD and achieve therapeutic effects.Through the network pharmacology，the potential mechanism of its multi-target and multi-pathway was initially revealed，which provides ideas for further research.

Keywords Network pharmacology; Molecular docking; Airway mucus hypersecretion; Acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease（AECOPD）; Qingfei Huatan Decoction

中圖分類號：R285文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.006

慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一種臨床常見疾病，具有高患病率、高死亡率、高致殘率、高疾病負(fù)擔(dān)的特點，2020年其患病率位列第3位[1]。COPD急性加重期（Acute Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary Disease，AECOPD）是指患者呼吸道癥狀的急性惡化，是COPD患者死亡的獨立危險因素，也是造成疾病負(fù)擔(dān)的重要部分，嚴(yán)重影響患者生命質(zhì)量及預(yù)后[2]。

AECOPD屬中醫(yī)學(xué)“咳嗽、喘證、肺脹”等范疇，痰熱壅肺、痰瘀互阻為AECOPD的病機關(guān)鍵[3-4]。痰熱壅肺證為其最常見證型[5]。清熱化痰兼以化瘀為AECOPD的關(guān)鍵治法，治療AECOPD療效確切[6-7]。清肺化痰方為張煒教授經(jīng)驗方，由經(jīng)方千金葦莖湯加減化裁而成，針對AECOPD痰、熱、瘀的核心病機，組方包括開金鎖、冬瓜子、桃仁、杏仁、蘆根、桔梗、橘紅、橘絡(luò)、敗醬草、虎杖、魚腥草、枳殼，具有清熱化痰、祛瘀通絡(luò)、止咳平喘之功。本研究前期臨床試驗提示，清肺化痰方聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)治療可以協(xié)同增效，能夠有效改善AECOPD患者咳嗽、咳痰等臨床癥狀，改善痰液性狀積分、改善痰黏蛋白等指標(biāo)，但其有效作用的具體機制尚未明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的不斷進步和應(yīng)用，為清肺化痰方的臨床效應(yīng)機制研究提供了有力的幫助，本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理和分子對接的技術(shù)和方法，構(gòu)建清肺化痰方治療AECOPD的成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，并分析該方多成分-多靶點間復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系，預(yù)測其改善AECOPD氣道黏液高分泌的潛在作用靶點和內(nèi)在機制，為深入的研究提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 清肺化痰方的活性成分和預(yù)測靶點 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索了清肺化痰方中12味中藥相關(guān)的活性成分，篩選出其中口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18者，并結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫將符合標(biāo)準(zhǔn)的活性成分靶點信息基因名規(guī)范化。

1.2 AECOPD氣道黏液高分泌機制相關(guān)靶點的預(yù)測? 以“Acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease airway mucus hypersecretion”，“AECOPD airway mucus hypersecretion”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）中檢索相關(guān)基因，刪重，最終得到AECOPD氣道黏液高分泌相關(guān)靶基因。

1.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將清肺化痰方有效成分靶點與AECOPD氣道黏液高分泌相關(guān)靶點進行映射，取交集，借助Cytoscape3.7.2軟件完成活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)篩選關(guān)鍵靶點 將篩選后交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，選擇物種為“Homo Sapiens”，置信度>0.4，獲得的信息數(shù)據(jù)，輸入Cytoscape進行可視化做圖。

1.5 生物信息富集分析 將清肺化痰方的作用靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//DAVID.ncifcrf.gov），進一步進行基因本體論（Gene Ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，借助R包（Ggplot2）將其中P.adjust<0.05的生物過程及信號通路可視化。

1.6 基因-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為清晰展示經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，清肺化痰方治療AECOPD氣道黏液高分泌，所涉及的信號通路及基因，本研究進行了進一步的網(wǎng)絡(luò)可視化。將KEGG分析所獲得的信號通路，及交集靶點富集到相關(guān)信號通路的基因，輸入Cytoscape，進行了基因通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。此網(wǎng)絡(luò)代表了清肺化痰方治療AECOPD氣道黏液高分泌所涉及的全部通路及基因。

1.7 活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接驗證 將上述網(wǎng)絡(luò)中結(jié)合靶點數(shù)目最多的活性成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中“Degree”值最大的靶點進行分子對接，以對接分?jǐn)?shù)值（Docking Score）對潛在核心成分與關(guān)鍵靶點之間的結(jié)合活性進行評價。我們采用ChemBioDraw Ultra 17.0畫出化合物槲皮素（Quercetin）、木犀草苷（Luteolin）、山柰酚（Kaempferol）、川陳皮素（Nobiletin）、刺槐素（Acacetin）和β-谷甾醇（Beta-sitosterol）的結(jié)構(gòu)，然后用ChemBio3D Ultra 17.0轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，并使用MMFF94力場進行優(yōu)化。AKT1（Degree值為57），IL6（Degree值為55），CASP3（Degree值為53），VEGFA（Degree值為53）和EGF（Degree值為52）的三維結(jié)構(gòu)從RCSB Protein Data Bank（www.rcsb.org）下載得到，我們選取了AKT1的三維結(jié)構(gòu)（PDB ID：4gv1）、IL6的三維結(jié)構(gòu)（PDB ID：4ni9）、CASP3的三維結(jié)構(gòu)（PDB ID：4qub）、VEGFA的三維結(jié)構(gòu)（PDB ID：5fv1）和EGF的三維結(jié)構(gòu)（PDB ID：2kv4）作為本課題對接所用的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)和化合物Genistein均使用AutodockTools 1.5.6[8-9]轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。本課題采用Autodock vina 1.1.2[10]進行分子對接研究。除了特別說明，其他參數(shù)均采用默認(rèn)值。最后，選取打分值最高的構(gòu)象用Free Maestro 11.9進行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 清肺化痰方活性成分及作用靶點信息收集?? 通過TCMSP檢索到符合標(biāo)準(zhǔn)的清肺化痰方活性成分共112個，其中開金鎖15個、冬瓜子2個、桃仁23個、杏仁19個、蘆根1個、桔梗7個、橘紅9個、橘絡(luò)1個、敗醬草13個、虎杖10個、魚腥草7個、枳殼5個。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將以上活性成分最后的預(yù)測靶點進一步規(guī)范化，刪重后，最終總計得到作用靶點基因236個。

2.2 AECOPD氣道黏液高分泌機制相關(guān)靶點的收集 使用GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫總計收集到AECOPD氣道黏液高分泌機制相關(guān)靶點764個。

2.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)分析 計算得到67個交集靶點，提示清肺化痰方可通過以上67個靶點改善AECOPD氣道黏液高分泌。67個靶點對應(yīng)54種有效活性成分，詳細信息見表1。利用Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，其涵蓋132個節(jié)點與366條表示活性成分和靶點之間的相互關(guān)系的邊。見圖1。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò) PPI網(wǎng)絡(luò)包含67個節(jié)點（蛋白），918條邊（蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系）。圖中顏色由外到內(nèi)顏色越深表示該蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用程度（Degree）越高。本研究篩選出在網(wǎng)絡(luò)圖中起關(guān)鍵作用的——顏色最深的、節(jié)點度值最大的5個靶點蛋白，分別是AKT1（Degree值為57）、IL6（Degree值為55）、CASP3（Degree值為53）、VEGFA（Degree值為53）、EGF（Degree值為52）。見圖2。

2.5 GO功能富集與KEGG通路富集分析 將最終的關(guān)鍵靶點進行GO與KEGG富集分析，最終本文將P-adj<0.05排名前20的GO中生物過程（BP）條目繪制柱狀圖。見圖3。包括腺體發(fā)育、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)等生物過程，篩選出6條KEGG顯著富集的通路，包括TNF信號通路、IL-17信號通路、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑抵抗、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路。見圖4。

2.6 基因-通路網(wǎng)絡(luò)分析 使用Cytoscape軟件將TNF、IL-17信號通路等6條KEGG通路信息和富集基因構(gòu)建了包含35個核心目標(biāo)基因和6條通路的基因-通路網(wǎng)絡(luò)。見圖5。

2.7 分子對接 根據(jù)以上結(jié)果，將槲皮素（Quercetin）、木犀草苷（Luteolin）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol）、刺槐素（Acacetin）等預(yù)測靶點最多的活性成分與AKT1、IL6、CASP3、VEGFA、EGF等度值最大的靶點進行分子對接，結(jié)果提示均具有良好的結(jié)合活性。見表2，圖6。

3 討論

AECOPD常以喘息、咳嗽加劇，咳吐大量黃濃痰為典型表現(xiàn)，屬于中醫(yī)學(xué)肺臟、喘病范疇，氣道黏液高分泌是引起患者咳嗽咳痰病理生理機制[11]，貫穿著COPD發(fā)生發(fā)展全過程，是影響病情和預(yù)后的獨立危險因素[2]，管理氣道黏液高分泌為COPD治療的重要目標(biāo)[12]，而中醫(yī)藥治療在AECOPD改善氣道黏液高分泌中具有關(guān)鍵作用。痰、熱、瘀為AECOPD的病機關(guān)鍵，久病入絡(luò)，AECOPD患者多見痰熱瘀搏結(jié)損傷肺絡(luò)，故清熱化痰、化瘀通絡(luò)以復(fù)肺之宣肅，為重要治法，千金葦莖湯具有清肺化痰，逐瘀排膿之功，為臨證常用經(jīng)方，既往多項研究表明葦莖湯為基礎(chǔ)的方藥治療AECOPD具有確切療效[13-14]，以清熱化痰法為代表的中醫(yī)藥能顯著改善AECOPD患者咳嗽咳痰等癥狀、有效改善COPD大鼠或患者的氣道黏液高分泌狀態(tài)[15-19]。在此基礎(chǔ)上張煒教授以千金葦莖湯加減、結(jié)合現(xiàn)代研究及臨證經(jīng)驗，擬清肺化痰方，作為曙光醫(yī)院呼吸科AECOPD痰熱壅肺證患者協(xié)定方，能明顯改善患者咳嗽、咳痰癥狀及氣道黏液高分泌情況，然而其具體作用機制尚未明晰。因此，我們采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法探究其作用的有效成分和可能機制。

本研究結(jié)果顯示，基于“藥物活性成分-疾病靶點”可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，揭示了清肺化痰方多成分、多靶點的作用特點，研究得到了54種活性成分，主要包括槲皮素（Quercetin）、木犀草苷（Luteolin）、山柰酚（Kaempferol）、川陳皮素（Nobiletin）、刺槐素（Acacetin）等黃酮類化合物，β-谷甾醇（Beta-sitosterol）等植物甾醇類化合物，通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI后篩選出前5個節(jié)點度值的靶點蛋白，分別是AKT1（Degree值為57），IL6（Degree值為55），CASP3（Degree值為53），VEGFA（Degree值為53），EGF（Degree值為52），AKT是PI3K下游的關(guān)鍵蛋白，抑制PI3K/Akt信號通路能有效降低MUC5AC蛋白的表達[20-21];白細胞介素-6（IL-6）是最重要的炎癥介質(zhì)之一，在AECOPD過程中明顯升高，可有效預(yù)測AECOPD的進展，是影響AECOPD發(fā)生發(fā)展的危險因素[22]，可通過調(diào)節(jié)核因子 -κB通路參與AECOPD的炎癥反應(yīng)及黏液高分泌過程[23];MUC5B為氣道黏蛋白的重要成分之一，IL-6介導(dǎo)JAK2依賴的自分泌或旁分泌途徑可促進MUC5B基因的表達，同時還可通過ERK信號傳導(dǎo)通路上調(diào)MUC5B基因的表達[24]，也有研究提示COPD及AECOPD大鼠、患者IL-6水平與MUC5AC等氣道黏蛋白正相關(guān)[25-27];血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是在肺組織的氣管中表達的一種糖基化多肽因子，在氣道重塑中發(fā)揮重要作用，可通過IL-13依賴和非依賴機制誘導(dǎo)黏液化生[28]。在呼吸道中，香煙煙霧（CS）可誘導(dǎo)表皮生長因子（EGF）的受體EGFR活化，從而導(dǎo)致GCM和凝膠形成黏蛋白MUC5AC的過表達[29]。

KEGG富集得到的通路主要是TNF信號通路、IL-17信號通路、EGFR酪氨酸酶抑制劑抵抗、PI3K-AKT信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路等。TNF-α能上調(diào)氣道上皮細胞EGFR的表達而直接刺激黏蛋白合成，也可通過影響核因子 -κB核使MUC基因表達增加，從而使黏液合成增多[30-31];EGFR酪氨酸酶抑制劑抵抗路徑可通過激活下游PI3K-AKT、MAPK信號通路來促進細胞的增殖或分化，EGFR的表達和活化與氣道上皮杯狀細胞增生、黏液產(chǎn)生正相關(guān)[32];在激活I(lǐng)L-17通路后最終也會促進MUC5AC、MUC5B基因表達，引起氣道黏液高分泌[33]。PI3-KAkt通路的激活可干擾p38MAPK而下調(diào)MUC基因轉(zhuǎn)錄，抑制PI3K/Akt信號通路能夠有效降低MUC5AC蛋白的表達[21];HIF-1是多種炎癥反應(yīng)輸入的一種中心調(diào)控遞質(zhì)，可作為順式激活調(diào)控因子啟動小鼠MUC5AC的活性[34]，而香煙煙霧能上調(diào)HIF-1α的活性，并通過EGFR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)MUC5AC的表達進而刺激黏液分泌[35]，臨床研究證明HIF-1α在COPD的患者中過表達，其激活不僅可引起下游EGFR/PI3K/AKT途徑上調(diào)炎癥介質(zhì)的表達，又可通過負(fù)反饋作用上調(diào)自身HIF-1α的表達，加劇COPD的病理變化，影響氣道黏液高分泌[36];鐘云青等[37]通過臨床患者支氣管活檢數(shù)據(jù)證明，p-p38MAPK免疫陽性在穩(wěn)定的COPD患者中顯著增加，提示p-p38MAPK的激活可能在COPD支氣管炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)中起重要作用，而MAPK途徑亦可通過配體依賴的方式來誘導(dǎo)MUC的合成。使用分子對接對最終篩選的小分子與蛋白之間的關(guān)系進行驗證，并進一步打分以評估其相互作用強度大小，分值>5.0表明有較好的結(jié)合活性，分值>7.0表明具有強烈的結(jié)合活性，AKT1、IL-6、CASP3、VEGFA、EGF這5個核心靶點蛋白對應(yīng)親和力數(shù)值最高的成分包括quercetin、acacetin、luteolin、beta-sitosterol對應(yīng)結(jié)合能分別為-8.2 kcal/mol、-6.7 kcal/mol、-9.2 kcal/mol、-5.5 kcal/mol、-7.4 kcal/mol，提示主要靶標(biāo)蛋白與清肺化痰方關(guān)鍵活性成分結(jié)合性均較好，表明清肺化痰方能直接改善AECOPD氣道黏液高分泌。

綜上所述，本研究研究了清肺化痰方的主要活性成分，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析并闡述了其改善AECOPD氣道黏液高分泌的重要靶標(biāo)以及相關(guān)通路，同時結(jié)合分子對接進一步驗證了清肺化痰方的主要活性分子能較好與關(guān)鍵作用靶點發(fā)生相互作用，揭示了清肺化痰方改善AECOPD氣道黏液高分泌的可能機制，為后續(xù)深入驗證和探究清肺化痰方改善AECOPD氣道黏液高分泌的分子機制提供了基礎(chǔ)。

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（2020-07-21收稿 責(zé)任編輯：魏慶雙，徐穎）