指紋圖譜結(jié)合一測多評法評價(jià)艾納香藥材質(zhì)量

寶艷儒，馮貽東，曾偉珍，葉文才，馮漢林*

（1.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣州510632；2.深圳海王醫(yī)藥科技研究院有限公司，深圳518057）

艾納香為菊科植物艾納香 （Blumea balsamifera）的干燥地上部分，主要分布于我國廣西、貴州、廣東、云南等省，是提取艾片的主要植物來源。艾納香性辛、苦，溫，具有溫中活血、祛風(fēng)除濕、消炎鎮(zhèn)痛之功效[1]。現(xiàn)代化學(xué)及藥理學(xué)研究表明艾納香主要含有黃酮、萜類、以及皂苷類成分，具有保肝[2]、抗氧化[3,4]、抗癌等藥理活性[5,6]。 研究表明黃酮類成分是艾納香中含量較高的一類成分，不同季節(jié)的黔產(chǎn)艾納香藥材中總黃酮含量可達(dá)4%～10%。艾納香黃酮類成分具有豐富的藥理活性，如抗腫瘤、保肝護(hù)肝、抗氧化、抗酪氨酸激酶等生物活性[7]。但目前黃酮類含量的測定主要集中在對總黃酮或單一組分的測定[8-11]。多指標(biāo)評價(jià)雖然能全面的表征藥材質(zhì)量，但存在的對照品用量大，部分對照品價(jià)格昂貴或不易獲得等缺點(diǎn)。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)首次采用一測多評法（QAMS）對艾納香藥材中7種黃酮類成分進(jìn)行含量測定，同時(shí)通過建立艾納香藥材的HPLC指紋圖譜，以期為艾納香藥材的綜合質(zhì)量評定提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 series高效液相色譜儀，配有二極管陣列(DAD)檢測器，四元泵溶劑洗脫系統(tǒng)，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，十萬分之一電子天平(METTLER TOLEDO儀器有限公司)；數(shù)顯數(shù)控超聲波清洗器(型號:KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；乙腈(色譜純級，F(xiàn)isher Scientific公司)；水為純凈水(自制)；其余試劑為分析純。

1.2 材料

金絲桃苷對照品(批號111521-201004；純度93.9%)；槲皮素對照品(批號100081-200907；純度99.1%)購自中國食品藥品檢定研究院；3-甲氧基槲皮素 （批號191128；純度99.68%）、怪柳黃素 （批號200123；純度98.21%）、艾納香素（批號101216；純度98.46%）、鼠李素（批號200116；純度98.05%）均購自成都植標(biāo)化純生物科技有限公司，艾納香甲素為實(shí)驗(yàn)室自制（3,3',5,7-tetrahydroxy-4'-methoxyflavanone），通過1H-NMR和13C-NMR等方法確定其結(jié)構(gòu)，并利用面積歸一化法計(jì)算得到其質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%；其他試劑為分析純。12批艾納香藥材分別采購于貴州、云南、廣西，經(jīng)譚道鵬博士鑒定為艾納香Blumea balsamifera，樣品標(biāo)本保存于深圳海王醫(yī)藥科技研究院有限公司研發(fā)中心標(biāo)本室，樣品詳細(xì)信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，分別置于容量瓶中，加甲醇超聲使溶解，配制成濃度為1mg/ml的對照品儲(chǔ)備液，分別精密吸對照品儲(chǔ)備液適量，置同一25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，依次制成濃度為21.32、21.16、20.40、20.32、17.84、10.32、19.32、11.25μg/ml 的混合對照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱定艾納香藥材1.0 g,置50 mL量瓶中，加入3/4體積甲醇，超聲處理（功率250W，頻率3kHz）30min，取出，放冷，用甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45μm濾膜，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱:依利特C18（4.6×250mm,5μm）；流動(dòng)相為乙腈(B)-0.2%甲酸(A)，梯度洗脫 （0～10min,16%B;10～15min,16～19%B；15～20min,19～25%B；20～30min,25%B；30～45min,25～28%B；45～55min,28%B；55～70min,28～40%B；70～80min,40～90%B）；流速:0.8mL/min；檢測波長:271 nm；柱溫:30C；進(jìn)樣量:10μL。理論塔板數(shù)按艾納香甲素計(jì)算≥5000。在此條件下，艾納香中7種化學(xué)成分與相鄰峰的分離度均＞1.5，結(jié)果見圖1。

圖1 混合對照品(A)和艾納香提取物(B)溶液色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standards(A)and extract solution of Blumea balsamifera(B)

2.4 指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證

精密吸取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液10μL連續(xù)進(jìn)樣6次，再取同一供試品溶液，分別在溶液制備后0、8、12、24h進(jìn)樣分析，再精密稱取同一樣品粗粉1.0 g，按2.2項(xiàng)下方法同時(shí)制備6份供試品溶液后進(jìn)樣測定，上述實(shí)驗(yàn)均分別在271 nm波長下檢測，以艾納香甲素為參照（S），計(jì)算其他共有峰相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，艾納香甲素等7種黃酮類成分的相對保留時(shí)間的RSD值均小于0.86%，共有峰相對峰面積的RSD值均小于3%，表明儀器精密度、供試品溶液穩(wěn)定性以及樣品處理方法的重復(fù)性均良好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 共有模式的建立及部分共有峰的指認(rèn)

將12批艾納香提取物的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件，以S2為參照譜，使用中位數(shù)進(jìn)行自動(dòng)匹配，加以多點(diǎn)校正，生成了指紋圖譜共有模式，標(biāo)定出17個(gè)共有峰。通過與混合對照品的保留時(shí)間及紫外吸收光譜圖比對，對其中7個(gè)共有峰進(jìn)行了指認(rèn)，分別為金絲桃苷、艾納香甲素、槲皮素、3-甲氧基槲皮素、怪柳黃素、艾納香素、鼠李素，詳見圖1。

2.5.2 艾納香指紋圖譜的相似度評價(jià)

以共有模式作為對照指紋圖譜，對12批樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度評價(jià)，結(jié)果12批樣品與對照圖譜間的相似度分別為0.999、0.999、0.994、0.993、0.990、0.982、0.971、0.968、0.969、0.961、0.982、0.989， 均大于0.960，表明所建立的指紋圖譜相似度良好，可用于艾納香藥材的質(zhì)量評價(jià)，樣品疊加圖見圖2。

圖2 12批艾納香藥材HPLC疊加圖Fig.2 Overlapping chromatograms of 12 batches of samples

2.5.3 聚類分析

分別以艾納香指紋圖譜中標(biāo)定的共有峰的峰面積為變量，采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件，首先對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，聚類方法采用歐氏距離，結(jié)果見圖3。根據(jù)聚類分析結(jié)果，可將艾納香藥材大致分為4類，第I類包括S5、S6、S11、S12；第II類包括S7、S8、S9，第III類包括S1、S2、S3、S4，；第IV類僅包括S10，樣品的分類基本與產(chǎn)地一致。而樣品10與其它均不同，可能是由于樣品的為其它產(chǎn)地混進(jìn)品種，或在加存放加工過程產(chǎn)生差異，還需進(jìn)一步考察。

圖3 聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of clustering analysis

2.5.4 主成分分析

將12批樣品17個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0軟件，數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析，主成分個(gè)數(shù)提取原則是提取主成分對應(yīng)的特征值大于1的前4個(gè)主成分，其累積貢獻(xiàn)率達(dá)到89.39%，包括了大部分信息。其中前4個(gè)主成分特征值分別為8.064、4.079、2.019、1.034，方差貢獻(xiàn)率分別為47.435%、23.997%、11.874%、6.083%。以17個(gè)共有峰的峰面積為變量，導(dǎo)入SICMA-P 15軟件，繪制主成分得分圖，詳見圖4。根據(jù)得分圖，12批艾納香樣品可分為四類，與聚類分析結(jié)果基本一致。

圖4 12艾納香樣品指紋圖譜主成分分析得分圖Fig.4 Principal components analysis scores plot

2.6 一測多評法測定7個(gè)黃酮的含量

2.6.1 線性關(guān)系考察

取混合對照品儲(chǔ)備液適量，逐級稀釋得到系列濃度的混合對照品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定。以對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性分析，結(jié)果見表2。從回歸方程可知，7種對照品在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。

表2 對照品線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)線性范圍Tab.2 Linear regression equation,correlation coefficient，linear range of 7 compounds.

2.6.2 精密度試驗(yàn)

取同一份艾納香供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果顯示7個(gè)成分峰面積的RSD分別為1.53%、1.00%、1.78%、1.24%、0.86%，1.11%和1.05%，表明該方法精密度良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批艾納香藥材，按照“2.2”項(xiàng)的方法平行配制6份供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，測得供試品溶液的RSD分別為0.37%、0.35%、0.54%、0.42%、1.07%、2.58%和1.58%。結(jié)果表明，上述7個(gè)化合物的重復(fù)性較好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取艾納香供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)的方法配制供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)的色譜條件在放置0、8、24h后進(jìn)行測定。峰面積的RSD分別為0.36%、0.23%、0.43%、0.04%、1.46%、0.43%和0.47%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取艾納香藥材6份，每份0.5 g，分別加入各對照品適量，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果的平均回收率分別為:103.85%，93.36%，95.03%，101.61%，102.43%，98.63%，99.59%，RSD分 別 為1.06%，0.79%，2.02%，3.01%，2.78%，2.64%和2.88%。結(jié)果見表3。

表3 艾納香中7種黃酮類成分加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery test of seven compounds in Blumea balsamifera

2.7 相對校正因子

2.7.1 相對校正因子的計(jì)算

參照文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)采用多點(diǎn)校正法計(jì)算相對較正因子，即以多個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)計(jì)算所得的相對校正因子的平均值作為含量計(jì)算用相對校正因子(fi/s)。具體公式為fi/s=fi/fs=(Ai×Cs)/(As×Ci)(式中As為內(nèi)參物峰面積，Cs為內(nèi)參物濃度，Ai為待測組分峰面積，Ci為待測組分濃度)。取混合對照品溶液，依次進(jìn)樣4、6、8、10、12、14L，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件平行進(jìn)樣測定，記錄色譜峰峰面積。以艾納香甲素為內(nèi)參物，分別計(jì)算金絲桃苷、槲皮素、3-甲氧基槲皮素苷、怪柳黃素、艾納香素和鼠李素對于艾納香甲素的相對校正因子，結(jié)果見表4。

表4 槲皮素等6種黃酮類成分與艾納香甲素的相對校正因子Tab.4 Relative correction factors(RCF)of six compounds

2.7.2 不同流速對相對校正因子的影響

本實(shí)驗(yàn)分別考察了不同流速(0.7、0.8、0.9 m L/min)對f的影響，結(jié)果各f的RSD值依次為0.28%、0.78%、0.03%、0.72%、0.27%和0.92%，表明不同流速對各成分的f無顯著影響。

2.7.3 不同柱溫對相對較正因子的影響

本實(shí)驗(yàn)分別考察了不同柱溫(25、30、35℃)對f的影響，結(jié)果各f的RSD值依次為1.13%、2.09%、0.43%、0.69%、0.36%和4.48%，表明不同流速對各成分的f無顯著影響。

2.7.4 不同儀器、色譜柱對相對較正因子的影響

分別考察不同的高效液相色譜儀（agilent1260，agilent1100），不同色譜柱（依利特C18,250 mm×4.6 mm，5μm;費(fèi)羅門C18,250 mm×4.6 mm，5μm； 安捷倫C18,250 mm×4.6 mm，5μm）對各f的影響，結(jié)果各的RSD值依次為1.17%，3.30%，4.22%，3.89%，2.16%，3.70%。表明不同儀器、不同色譜柱對各成分的f無顯著影響，結(jié)果見表5。

表5 不同儀器及色譜柱測得的相對校正因子Tab.5 RCF tested by different factors

2.7.5 待測成分色譜峰的定位

對待測成分色譜峰準(zhǔn)確定位是一測多評的前提，文獻(xiàn)通常所用方法為相對保留時(shí)間定位或保留時(shí)間差值定位[12]。但試驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)，在不同型號高效液相色譜儀上，各成分的保留時(shí)間差的波動(dòng)比較大，RSD均＞10.0%，但在同一儀器不同色譜柱上的相對保留時(shí)間的的波動(dòng)相對較小，所以本實(shí)驗(yàn)選擇用相對保留時(shí)間法進(jìn)行峰定位，結(jié)合對照品確定各成分位置。結(jié)果見表6。

表6 不同儀器和色譜柱測得的相對保留時(shí)間Tab.6 Relative retention time tested by different instruments and columns

2.8 一測多評法(QAMS)與外標(biāo)法測定結(jié)果比較

精密稱取12批艾納香藥材1.0 g，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法（ESM）和QAMS法計(jì)算其含量，結(jié)果見表6。采用SPSS 20.0軟件對2種方法與其平均值進(jìn)行分析比較，t檢驗(yàn)結(jié)果均為P＞0.05，表明2種方法計(jì)算結(jié)果無顯著性差異，說明所建立的一測多評法是可行的。

表7 ESM和QAMS 2種方法計(jì)算所得含量比較(n=2)Table 7 Content determined by ESM and QAMS methods(n=2)

批次 怪柳黃素（%） 艾納香素（%） 鼠李素（%）ESM QAMS ESM QAMS ESM QAMS 1 0.58 0.58 5.76 5.70 2.79 2.76 2 0.71 0.71 4.97 4.92 2.53 2.50 3 0.37 0.37 4.21 4.16 1.33 1.31 4 0.48 0.48 3.45 3.41 1.12 1.11 5 0.28 0.28 2.28 2.26 0.80 0.80 6 0.16 0.16 3.89 3.85 1.15 1.13 7 0.60 0.60 3.25 3.21 2.47 2.44 8 0.37 0.37 5.05 4.99 2.54 2.51 9 0.96 0.97 5.90 5.84 2.44 2.41 10 0.55 0.55 5.67 5.61 2.99 2.95 11 0.30 0.31 2.58 2.55 1.26 1.24 12 0.32 0.32 3.08 3.05 1.82 1.80

3 討論

色譜條件的確定:本實(shí)驗(yàn)首先考察了甲醇-水和乙腈-水兩種系統(tǒng)，確定該樣品在乙腈環(huán)境下分離度更好，接下來又分別對乙腈-0.4%磷酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液體系進(jìn)行考察，最后通過比較化合物個(gè)數(shù)、出峰時(shí)間、分離度以及峰型最終確定乙腈-0.2%甲酸水溶液為最佳流動(dòng)相組成。分別對7個(gè)黃酮化合物的紫外光譜進(jìn)行掃描分析，確定其最大吸收波長主要集中在250～290nm之間，最后結(jié)合峰數(shù)目，峰形、分離度、對稱因子等參數(shù)，確定271nm為最終波長。本文所選對照品均為艾納香中含量較高且能夠購買的樣品，7個(gè)對照品所占峰面積接近艾納香藥材總峰面積的70%，且為艾納香中的主要代表類黃酮成分，能有效地表征艾納香藥材質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)在建立HPLC指紋圖譜的同時(shí)，確定了17個(gè)共有峰，并對其中7個(gè)黃酮類化合物進(jìn)行了指認(rèn)。同時(shí)通過與外標(biāo)法比較，確定所建立的一測多評法方法方便準(zhǔn)確。與現(xiàn)有文獻(xiàn)相比，本文首次對艾納香中黃酮類成分進(jìn)行了一測多評的分析，同時(shí)還建立了以黃酮類物質(zhì)為主的指紋圖譜，所以本文對艾納香黃酮類物質(zhì)的深入研究提供了質(zhì)量方面的基礎(chǔ)。黃酮類成分為艾納香藥材中的重要組成部分，且具有較好的藥理活性，深圳海王醫(yī)藥科技研究院有限公司以艾納香總黃酮為主要藥效成分的艾心酮片目前已獲得臨床批件，正在進(jìn)行II臨床。而物質(zhì)基礎(chǔ)是藥理活性的有效保障，單一成分不能科學(xué)全面的反應(yīng)藥材的質(zhì)量，本文以艾納香甲素為內(nèi)標(biāo)，通過同時(shí)測定7種黃酮類成分，能更有效的評價(jià)艾納香藥材的質(zhì)量，且該方法準(zhǔn)確性較好，簡單可行，有效地節(jié)約檢測成本，可實(shí)現(xiàn)對艾納香的質(zhì)量評價(jià)。