人參內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)及其與有效成分相關(guān)性分析

張亞光，張艷欣，高 崎

（上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司·上海上海·201703）

人參為五加科植物人參 （Panax ginseng C.A.Mey）的干燥根和根莖，是我國傳統(tǒng)中藥材，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，認(rèn)為其具有大補(bǔ)元?dú)?、安神益智的功效，在現(xiàn)代臨床藥理研究表明，人參能夠在提升免疫力、抗腫瘤、改善心血管等多個(gè)方面發(fā)揮顯著作用[1,2]。因栽培種植方式不同，人參有林下山參和園參之分，價(jià)格懸殊，質(zhì)量也存在差異。目前國內(nèi)外對人參道地藥材的研究主要集中于遺傳多樣性、藥理作用以及生態(tài)環(huán)境等方面，作為一系列生理生化反應(yīng)、能量與物質(zhì)代謝的植物體內(nèi)環(huán)境對藥材道地性的形成同樣具有重要的作用[3,4]。特別是藥材的生長發(fā)育過程中，一些次生代謝產(chǎn)物和有效藥用成分的累積與內(nèi)部真菌介導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)[5]。

田間人工種植條件下收獲的人參為園參，生長周期短，5年左右采收。林下山參的種植方式是將參籽廣播于山野林間，任其自然生長，一般稱生長年限在15年以上的為林下山參。從藥用成分含量及內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)角度揭示二者之間的差異，對于人參栽培方式的指導(dǎo)、質(zhì)量的控制以及市場環(huán)境的調(diào)節(jié)有一定的現(xiàn)實(shí)意義。人工條件下化肥和農(nóng)藥的施用會(huì)對土壤的理化特征造成影響，進(jìn)而改變了土壤微生物組成[6]。植物在生長過程中，和根際微生物逐步形成共生關(guān)系，所以兩者內(nèi)生菌會(huì)存在差異。說明人工干預(yù)的種植過程會(huì)對藥材中內(nèi)生菌為主的內(nèi)環(huán)境也產(chǎn)生影響[7]。

人參道地藥材的生長發(fā)育過程中，一些次生代謝產(chǎn)物和藥用成分的累積與內(nèi)部微生物介導(dǎo)的調(diào)節(jié)有直接關(guān)系[8]。本實(shí)驗(yàn)借助LC/MS技術(shù)對兩種不同的栽培方式的人參內(nèi)生真菌與人參主要藥用成分對含量相關(guān)性分析，為人參中真菌的開發(fā)和利用提供研究基礎(chǔ)。內(nèi)生真菌與植物所構(gòu)成的體內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)的初步研究，以及產(chǎn)生的化學(xué)成分的差異和影響，將有助于從內(nèi)部環(huán)境來闡釋道地人參藥材的形成機(jī)制[9]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

植物DNA提取試劑盒、引物合成、Tap Mix酶均由生工生物技術(shù)（上海）有限公司提供；甲醇、乙腈為色譜純購自德國Merck公司；乙醇、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、次氯酸鈉均為國藥有限公司提供；實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)品:人參皂苷Rg1 (批號 Z13O8L45576)、Re (批 號B10M8S35243)、Rb1(批 號Z16J9X52719)、Rc(批 號M18J9S53098)、Rd(批 號Z13N8X48155)、Rg2(批 號M17M8S31526)、Rb2(批號P09M8F35575)、Rf(批號P09M8F31017)、Rb3(批號Y05A8Y41182)購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

本研究在遼寧桓仁縣人參種植基地 （41。03＇N，125。30＇W）進(jìn)行，該地屬于中國的東北地區(qū)。共使用了10份新鮮人參樣本，根據(jù)種植方式分為兩組，5年參齡園參、林下山參各5支。從取樣區(qū)域中心位置內(nèi)設(shè)5點(diǎn)隨機(jī)取樣[10,11]，每組5支平行樣本。搖動(dòng)根以去除松散粘附的土壤，然后沖洗，直到根須上沒有可見的土壤顆粒，冷凍保鮮帶回實(shí)驗(yàn)室，用于植物內(nèi)生真菌18S基因分析[12]。我們將本研究中的植物共生微生物研究范圍明確為人參蘆頭下方1～3cm位置的根部去除外表皮后的內(nèi)部組織中的內(nèi)生真菌。

1.3 樣品的處理及DNA提取

搖動(dòng)根以去除松散粘附的土壤，超凈臺內(nèi)繼續(xù)用滅菌水清洗干凈樣品外表面，用無菌刀片將根莖樣品切成10×10mm的片段。取人參內(nèi)部組織片段先在75%乙醇溶液中表面浸泡1 min，轉(zhuǎn)移到5%次氯酸鈉溶液中7 min，之后用75%乙醇浸泡1 min[13]。將表面滅菌的樣品用無菌水漂洗5次，并用無菌濾紙吸干。取各樣品適量，將處理過的樣品取內(nèi)部組織剪碎放置研缽內(nèi)，液氮研磨后置1.5 mL無菌試管中，而后用試劑盒方法提取基因組DNA。DNA樣品用瓊脂糖凝膠電泳及紫外蛋白核酸測定儀(Nano Drop one，GENEQUANT，Eppendorf)檢測質(zhì)量與純度。將核酸濃度用去離子水調(diào)配到50 ng/μL，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化

以上述基因提取方法分別得到供試樣品DNA，并對植物的內(nèi)生真菌18S V5-V7區(qū)合成擴(kuò)增引物并分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增[14;15]，引物序列如下:

817F: （TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA），1196R:（TCTGGACCTGGTGAGTTTCC）；

內(nèi)生真菌PCR擴(kuò)增程序如下:

①95℃預(yù)變性5min；②95℃變性35s；③55℃退火35s；④72℃延伸50s；⑤步驟2～4循環(huán)25次；⑥72℃延伸5min；⑦4℃10min后終止。PCR反應(yīng)在ABI ProFlex PCR熱循環(huán)儀中進(jìn)行。擴(kuò)增后使用凝膠法純化回收并檢驗(yàn)。

1.5 高通量測序和分析

PCR反應(yīng)中擴(kuò)增出各DNA的18S區(qū)域，經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠法純化回收后，提交上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進(jìn)行測序[16]。全部序列經(jīng)過濾低重復(fù)序列和嵌合體后，進(jìn)行操作分類單元聚類，OTUs的相似性為97%，利用blastn將OTU序列逐條與Unite數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，比對的結(jié)果用于物種注釋，之后構(gòu)建目水平的物種分類圖[17]。使用R的vegan package進(jìn)行主成分分析（PCA），以Simpson多樣性指數(shù)進(jìn)行樣品之間的多樣性分析[18]。

1.6 液相和質(zhì)譜條件

色譜條件:色譜柱Waters CORTECS C18（150 mm×4.6 mm,2.7μm），檢測波長203 nm,柱溫30。C，進(jìn)樣量5μL，流速1.0 mL/min，A相為0.1%甲酸-水溶液，B相為0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫程序見表1所示。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution schedule

質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源（ESI）負(fù)離子檢測模式采集質(zhì)量范圍（Mass range）:50-1200 Da；毛細(xì)管電壓 （Capillary Voltage）:2.5 kV； 錐孔電壓（Sampling Cone Voltage）:30 V；離子源溫度（Soure Temperature）:120。C；去溶劑化溫度（Desolvation Temperature）:500。C；去溶劑化氣體流量 （Desolvation Gas Flow）:800 L/hr；錐孔氣體流量(Cone Gas Flow）:50 L/hr；碰撞氣:氬氣；校正液:0.5 mM甲酸鈉、2 ng/mL亮氨酸腦啡肽（Leu-enkephaline，LE），負(fù)離子模式下LE[M-H]-精確分子量以m/z 554.2615計(jì)；碰撞氣體氬氣；高碰撞能量通道:10～40 eV能量梯度。

1.7 主要成分含量的測定

1.7.1 樣品制備

取林下山參干品，粉碎，過5號篩（80目），精密稱定2.00 g，加70%甲醇20.00 mL，超聲（200 W,40 KHz）100 min，溫度50。C，濾過并棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液10.00 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至2 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22μm濾膜，即得。

1.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Rc對照品、人參皂苷Rd對照品、人參皂苷Rb2對照品、人參皂苷Rb3對照品、人參皂苷Rg2對照品各1.00 mg，加入甲醇溶解制成1.0 mg/mL的對照品溶液，再加甲醇逐級稀釋進(jìn)樣。以濃度縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，得到5種人參皂含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 主要成分線性方程表.Table 2 Table of main component linear equations

1.8 人參內(nèi)生真菌菌群結(jié)構(gòu)與人參皂苷含量的相關(guān)性分析方法

選取人參次生代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，同時(shí)對分析所得的內(nèi)生菌豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行排序，采用R語言統(tǒng)計(jì)軟件對內(nèi)生菌數(shù)據(jù)以及人參皂苷數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，形成相關(guān)性熱圖并得出相關(guān)性系數(shù)是否顯著(P＜0.05)。主要選擇可用于反映3種藥典中規(guī)定的皂苷檢測物（Rg1、Re和Rb1）以及2種高含量的人參皂苷檢出物（Rc、Rd）進(jìn)行進(jìn)一步分析?？捎糜诜从撑c人參內(nèi)生真菌群落中豐度排名前20的物種的相互關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的預(yù)處理結(jié)果以及PCR擴(kuò)增結(jié)果

樣品所提取的基因調(diào)配到同一濃度后采用瓊脂糖凝膠法檢驗(yàn)，基因完整性良好（如圖1）。采用適宜條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增、檢測和分析，以保證后續(xù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[19;20]。樣品內(nèi)生真菌擴(kuò)增后可得到適宜濃度產(chǎn)物。

圖1 基因組DNA電泳Figure 1 Genomic DNA electrophoresis

2.2 序列統(tǒng)計(jì)與多樣性分析

對10支人參內(nèi)生真菌的Miseq測序和聚類分析。測定得到522303條有效序列，按照97%的相似性聚成OTUs，共獲得137個(gè)OTUs。維恩圖代表樣品類群整體OTUs數(shù)目，兩組中分別含103和87個(gè)OTUs（圖2）。為比較不同產(chǎn)地人參內(nèi)生真菌群落的多樣性，按最小序列數(shù)44146抽平 （標(biāo)準(zhǔn)化）[21]。Shannon和Chao指數(shù)越大，說明對應(yīng)樣品中的真菌群落多樣性越豐富；Simpson指數(shù)則相反，指數(shù)越大，對應(yīng)樣品中的真菌群落多樣性越小。多樣性指數(shù)從高到低的順序?yàn)長＞R。如表2所示，分析得出園參中內(nèi)生真菌的多樣性較大。

圖2 不同栽培方式的人參內(nèi)生真菌OTU維恩圖Figure 2 Venn diagram of OTUs distribution of endophytic bacterial community detected in Ginseng

表3 不同栽培方式人參內(nèi)生真菌群落的多樣性分析Table 3 Diversity analysis of ginseng endophytic fungi community

2.3 人參內(nèi)生真菌相對豐度分析

門水平分類學(xué)分析圖(圖3)表明樣本中，多達(dá)70%的reads屬于子囊菌門真菌，L組為林下山參，R組為園參，門水平菌群相對豐度在兩類樣品之間有所不同。同齡林下山參和園參的內(nèi)生真菌組成存在差異[16,22]。對應(yīng)的真菌類群涉及到7個(gè)門 （子囊菌門Ascomycota、擔(dān)子菌門Basidiomycota、毛霉菌門Mucoromycota、纖毛亞門Ciliophora及一些相對豐度較小的門類），包括33綱、51目、62科[23]。

圖3 兩類樣品中內(nèi)生真菌多樣性Figure 3 Dominant bacterial genera detected from endophytic bacterial community in Ginseng

2.5 人參內(nèi)生真菌主成分分析

以兩種不同栽培方式人參樣品為目標(biāo)進(jìn)行PCA分析，通過對不同生境或微生物群落間的物種多樣性進(jìn)行組間比較分析，探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性[24,25]。其中，林下山參位于二、三象限，園參位于一、四象限，分異性較大。通過聚類和PCA分析表明，不同栽培方式的人參內(nèi)生真菌群落具有差異性。

圖4 兩類樣品中內(nèi)生真菌結(jié)構(gòu)PCA分析Figure 4 PCA analysis of endophytic fungal structure in two types of samples

2.6 人參化學(xué)成分含量測定結(jié)果，詳見表4。

表4 人參化學(xué)成分含量測定結(jié)果Table 4 Table of results of determination of chemical composition of ginseng

2.7 主要色譜峰的解析

人參皂苷是由人參皂苷元與糖通過-O-相連構(gòu)成的糖氧苷類化合物，電噴霧電離(ESI)屬于軟電離，人參皂苷類成分在負(fù)離子模式下的ESI源中通常具有良好的離子化效率，從而得到化合物相應(yīng)的相對分子質(zhì)量信息。通過UPLC-MSMS技術(shù)，為化合物的結(jié)構(gòu)解析提供豐富的信息。人參皂苷類成分的多級質(zhì)譜裂解規(guī)律表明，在碰撞能的作用下，人參皂苷主要發(fā)生糖苷鍵的斷裂，質(zhì)譜給出失去一個(gè)或多個(gè)糖的次級苷和苷元的碎片離子，從而幫助我們對人參皂苷進(jìn)行解析。本研究根據(jù)ESI（負(fù)離子）檢測模式下得到的碎片離子信息，對林下山參指紋圖譜所含的人參皂苷進(jìn)行解析。結(jié)果見表5。

表5 林下山參指紋圖譜共有峰的鑒定結(jié)果Table 5 Results of identification of common peaks of fingerprints of ginseng

2.8 基于人參的化學(xué)成分含量的林下山參與園參的鑒別

對林下山參和園參指紋圖譜進(jìn)行對比，共得到33個(gè)共有峰。以33個(gè)共有峰的峰面積為變量，導(dǎo)入SIMCA-P 14.0軟件中，進(jìn)行主成分分析，得到的結(jié)果如圖所示。顯示林下山參和園參樣品分布于坐標(biāo)軸左右兩側(cè)，表明之間存在質(zhì)量差異。

圖5 林下山參與園參的鑒別Figure 5 Differences in participating in garden ginseng under forest

2.9 化學(xué)成分和內(nèi)生真菌的相關(guān)性分析

經(jīng)過化學(xué)成分檢測，2種栽培方式的人參中Rg1、Rb1、Re含量均高于《中國藥典》2020年版中的人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)。其中Rc和Rd為檢測出的含量比較高的人參皂苷。為了進(jìn)一步分析與人參皂苷含量有相關(guān)性的內(nèi)生真菌，此處利用Spearman相關(guān)性分析建立兩種栽培方式人參內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌屬與人參皂苷含量的多元線性回歸方程，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分組并排序后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得出相關(guān)性系數(shù)（P＜0.05），最后將內(nèi)生真菌進(jìn)行篩選，構(gòu)建出相關(guān)性熱圖。

通過對人參內(nèi)生真菌群落中相對豐度前20的組成菌屬與人參皂苷有效成分含量的相關(guān)性分析表明，部分真菌類群與5種藥用活性成分的相關(guān)性較大，特別是指標(biāo)性成分Rg1、Re、Rb1。短梗霉屬、毛殼菌屬及曲霉菌屬球囊霉屬等均與藥典人參中3種藥用成分Rg1、Re、Rb1呈現(xiàn)含量正相關(guān)關(guān)系；子囊菌屬與Rg1、Rb1、Rc和Rd存在一定程度的負(fù)相關(guān)關(guān)系。這些結(jié)果表明，人參內(nèi)生真菌群落組成與人參皂苷活性成分之間存在相關(guān)性。

圖6 人參中化學(xué)成分和內(nèi)生真菌相關(guān)性熱圖Figure 6 Heat map of chemical composition and endophytic fungi in Ginseng

3 討論

植物與生長環(huán)境中接觸到的微生物互利共生，部分形成緊密共生關(guān)系。一些定殖的真菌在植物體內(nèi)發(fā)揮著重要的生態(tài)功能，對植物內(nèi)次生代謝物的形成起著重要調(diào)控作用，進(jìn)而改變植物對環(huán)境的適應(yīng)能力[26]。本研究中，園參和林下山參都與不同的內(nèi)生真菌群落密切相關(guān)。種子萌芽生根后先從自身或者當(dāng)?shù)氐耐寥拉h(huán)境中，預(yù)組裝成一定特有的內(nèi)生菌群，并應(yīng)用于內(nèi)部代謝的調(diào)節(jié)和抵抗外來微生物的入侵[27]。與園參相比，同參齡林下山參內(nèi)生真菌群含有較豐富的物種與遺傳多樣性，占主要地位的四門細(xì)菌菌群相對豐度在兩類樣品之間有所不同。園參生產(chǎn)中施用化肥會(huì)引入外來微生物，使用農(nóng)藥會(huì)對土壤環(huán)境中微生物的多樣性產(chǎn)生影響。林下山參和園參所使用的種子基源相同，而其中的內(nèi)生菌多樣性存在差異，不同栽培環(huán)境中的差異會(huì)引起真菌組成差異。

植物內(nèi)生菌是具有很大挖掘潛力的微生物資源，迄今已有眾多研究可以證實(shí)其與植物次生代謝產(chǎn)物的含量息息相關(guān)，一些研究發(fā)現(xiàn)，多粘類芽孢桿菌與人生共培養(yǎng)后可提高稀有皂苷含量，這就為道地藥材的深度研究提供了途徑[28,29]。本論文旨在開展道地藥材與不同品質(zhì)藥材內(nèi)生真菌差異研究，分析得到其種群多樣性和功能差異，可從內(nèi)生菌著手闡釋道地藥材形成的相關(guān)因素加以研究。同時(shí)為通過恢復(fù)原有微生物群落解決人參連作障礙提供研究資料。林下山參和園參不同的生長環(huán)境，影響著次生代謝物的積累過程，通過對五種主要人參皂苷的含量的準(zhǔn)確定量以及其他化合物質(zhì)成分含量的比較，從化學(xué)物質(zhì)含量差異揭示二者的差異。利用LC/MS技術(shù)，對化學(xué)物質(zhì)成分進(jìn)行進(jìn)一步解析，從而明確植物內(nèi)生菌與道地藥材的影響和關(guān)聯(lián)，為中藥材道地性的研究探索一條有效途徑。內(nèi)生真菌種類繁多，人參化學(xué)物質(zhì)成分復(fù)雜多樣，本文僅從人參皂苷與內(nèi)生菌的關(guān)聯(lián)來闡釋不同栽培方式人參的差異，后續(xù)研究可以對人參揮發(fā)油、多糖、有機(jī)酸等更全面的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行深入研究，以期更加全面解讀人參內(nèi)生菌群落與栽培方式的關(guān)聯(lián)性。