丹梔逍遙散減輕慢性心理應激模型小鼠的瘙癢癥狀機制研究

劉若一 鄒憶懷 徐立 張姝珺 郭蓉娟 趙鵬

瘙癢是困擾多種皮膚病患者的主要癥狀[1]，同時瘙癢性疾病患者存在著廣泛的焦慮、抑郁等不良心理狀態(tài)，而不良心理狀態(tài)可再度惡化瘙癢，使患者心理和身體兩方面承受著極大痛苦。國內(nèi)外多個獨立的流行病學研究也證實了瘙癢性疾病與焦慮、抑郁、精神緊張等不良心理狀態(tài)的關(guān)聯(lián)性。2020年發(fā)表的一項在歐洲13個國家進行的橫斷面研究表明，瘙癢在很大程度上增加了皮膚病患者的心理負擔[2]。無論是急性壓力還是慢性壓力，都會顯著影響健康人以及那些被診斷患有皮膚病和全身疾病的人的瘙癢癥狀，從而導致一種惡性循環(huán)，即壓力加劇瘙癢，反之亦然[3]。在治療上，心理治療對于緩解瘙癢也有著很大幫助，Pavlis J等[4]在分析了現(xiàn)有治療特應性皮炎的瘙癢的方法后發(fā)現(xiàn)患者教育、睡眠管理和緩解壓力是提高療效的重要手段。目前中醫(yī)學界也已注意到情緒心理與皮膚瘙癢的密切關(guān)系，從肝論治皮膚瘙癢有著良好的臨床療效，取得了臨床共識。但是，其作用機制依然是國內(nèi)外研究的空白。本研究從中醫(yī)情志致病觀點出發(fā)，聚焦于心理因素對瘙癢的惡化作用，選擇丹梔逍遙散這一從肝論治代表方，采用前期研究中建立的可以有效排除心理以外因素干擾的單純健康動物模型，探索丹梔逍遙散治療心理因素惡化的皮膚瘙癢的療效及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與藥物

健康雄性Balb/c小鼠，8周齡，飼養(yǎng)于恒溫(23～25℃)，光照12小時，黑暗12小時，食物和水自由供應。為了避免激素水平的日間變化對實驗結(jié)果的影響，所有實驗均在上午9點至12點間進行。

丹梔逍遙散方由牡丹皮3 g、梔子3 g、柴胡6 g、當歸6 g、白芍6 g、茯苓6 g、白術(shù)6 g、甘草3 g組成。上述藥物按成年人體質(zhì)量(70 kg)劑量的2倍水煎濃縮至含生藥量0.38 g/mL。

1.2 試劑與儀器

小鼠組胺(HIS)酶聯(lián)免疫試劑盒，96T，上海酶聯(lián)；N-甲基-對甲氧基苯乙胺與甲醛的縮合產(chǎn)物compound 48/80， Sigma公司，甲苯胺藍；標準規(guī)格酶標儀，Multiskan MK3，Thermo Scientific；自動洗板機，DEM-3型，北京拓普分析儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，SKP-02.600型，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；8 mm攝像機CCD-TRV86型，索尼公司。

1.3 造模與分組

采用課題組于2013年創(chuàng)建的“慢性心理壓力惡化搔抓行為”動物模型[5]。對健康小鼠實施慢性避水應激(water avoidance stress，WAS)：在直徑為55 cm的圓形水槽中央，放置一個直徑7 cm的站臺，將水槽注滿常溫水，水面高度低于平臺1 cm。每日上午將小鼠置于站臺上1小時，連續(xù)10天。

將實驗動物隨機分為3組：空白組、心理壓力組、心理壓力+丹梔逍遙散組。心理壓力+丹梔逍遙散組每天1小時WAS，每天1次，按0.04 mL/g體質(zhì)量中藥灌胃，連續(xù)10天；心理壓力組每天1小時WAS，每天1次等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)10天；空白組每天1小時單獨隔離，每天1次等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)10天。

1.4 搔抓行為學實驗

每組各取7只小鼠，最后一天WAS結(jié)束24小時后，將10 μg的compound 48/80溶于50 μL生理鹽水中，皮下注射到小鼠頸背部。注射后立即將每只小鼠放回單獨的籠子中，然后在安靜的條件下使用8 mm攝像機記錄搔抓行為120分鐘。一般來說，小鼠會在注射部位表現(xiàn)出幾處抓痕，持續(xù)約1秒，這種抓傷行為被算作一次搔抓。以每10分鐘為一輪，記錄每輪的搔抓次數(shù)。在分析實驗數(shù)據(jù)時，觀察者看不到任何關(guān)于分組及干預的信息。

1.5 皮膚肥大細胞數(shù)量檢測

每組各取7只小鼠于末次應激結(jié)束后24小時，取頸背部皮膚組織標本，每只小鼠各取3塊頸背部皮膚組織做組織切片，采用甲苯胺藍染色計算每個低倍視野(×100)皮膚肥大細胞的數(shù)量，各小鼠肥大細胞數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果為3次計數(shù)的平均值。所有的肥大細胞計數(shù)都是由兩個不同的研究人員在不考慮實驗條件的情況下進行的。

1.6 血漿組胺水平測定

取空白組、心理壓力組各5只小鼠，心理壓力+丹梔逍遙散組8只小鼠測量血漿組胺水平，于皮下注射compound 48/80前、注射后15分鐘、30分鐘和120分鐘時，用頸椎脫位處死8只小鼠，用心臟穿刺法獲取全血，然后收集在含乙二胺四乙酸采血管中。離心后的血漿保存在-80℃中，用于組胺的測定。使用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測量血漿組胺水平。分析丹梔逍遙散對該小鼠模型血中組胺分泌的時相、高峰、濃度的影響。

1.7 抑郁行為學研究

取空白組、心理壓力組、心理壓力+丹梔逍遙散組各8只小鼠進行實驗。采用空場實驗、強迫游泳實驗來檢測小鼠的抑郁程度以及分析丹梔逍遙散對抑郁行為學的改善效應。

1.7.1 空場實驗 將小鼠放入空場活動測試箱的4個圓桶(桶內(nèi)中央半徑為7.5 cm的區(qū)域劃分為中央?yún)^(qū))中，選擇空場實驗計算機圖像實時檢測分析系統(tǒng)中的抗抑郁模式。計算機自動記錄運動總路程、運動時間、平均速度、中央?yún)^(qū)的路程比率和時間比率等6個指標。同時人工記錄小鼠剛放進測試箱中5分鐘內(nèi)的直立(動物雙前肢同時離地，或者雙前肢放在桶壁上算作直立一次)次數(shù)。

1.7.2 強迫游泳實驗 將動物單獨地放在柱狀塑料桶中(水深15 cm，直徑20 cm)，水溫(25±1)℃。強迫游泳6分鐘，用秒表記錄后4分鐘內(nèi)小鼠的累積不動(小鼠停止掙扎或呈漂浮狀態(tài)，四肢有輕微動作以保持頭部在水面)時間。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 搔抓行為學試驗

對三組間搔抓次數(shù)進行雙因素方差分析后發(fā)現(xiàn)：三組間均存在統(tǒng)計學差異，心理壓力+丹梔逍遙散組搔抓次數(shù)較心理壓力組明顯下降，然而較空白組增多，對各時段數(shù)據(jù)的單因素方差分析表明在0～10分鐘、10～20分鐘、100～110分鐘，心理壓力+丹梔逍遙散組與心理壓力組間存在顯著差異，表明服用丹梔逍遙散顯著降低了慢性心理壓力模型小鼠的搔抓次數(shù)，尤其在觀察的早期階段效果明顯。結(jié)果如圖1。

圖1 丹梔逍遙散對compound 48/80誘導的搔抓行為的影響

2.2 皮膚肥大細胞數(shù)量檢測

心理壓力組與空白組皮膚肥大細胞數(shù)量存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，心理壓力組數(shù)量高于空白組；心理壓力+丹梔逍遙散組皮膚肥大細胞數(shù)量與其余兩組比較均無統(tǒng)計學差異。結(jié)果如表1所示。

表1 各組小鼠皮膚肥大細胞數(shù)量比較

2.3 血漿組胺水平測定

心理壓力組與空白組、心理壓力組與心理壓力+丹梔逍遙散組間血漿組胺水平比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，空白組與心理壓力+丹梔逍遙散組血漿組胺水平均低于心理壓力組，心理壓力組+丹梔逍遙散與空白組間比較無統(tǒng)計學差異。在15分、30分、120分時，心理壓力+丹梔逍遙散組血漿組胺水平顯著低于心理壓力組，故丹梔逍遙散可顯著降低慢性心理壓力模型小鼠的血漿組胺水平。結(jié)果如表2所示。各組小鼠血漿組胺水平隨時間變化趨勢如圖2所示。

表2 各組小鼠各時間點血漿組胺水平的比較

圖2 丹梔逍遙散對血漿組胺水平的影響

2.4 空場實驗

三組間直立次數(shù)均存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，心理壓力+丹梔逍遙散組小鼠在空場實驗中直立次數(shù)多于心理壓力組，少于空白組。結(jié)果如表3所示。

表3 各組小鼠直立次數(shù)的比較

2.5 強迫游泳實驗

三組間不動時間均存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，心理壓力+丹梔逍遙散組小鼠在強迫游泳實驗中不動時間多于空白組，少于心理壓力組。結(jié)果如表4所示。

表4 各組小鼠不動時間的比較

3 討論

劇烈、長期、反復瘙癢的不愉快體驗及局部皮損的惡化，給患者帶來巨大的心理壓力，而心理壓力亦可直接惡化瘙癢癥狀及局部皮損；搔抓可以短暫解除瘙癢引起的不愉快的體驗，得到欣快感，久而久之，搔抓還泛化為患者緩解其他心理壓力的應對方式。故心理壓力參與了瘙癢搔抓惡性循環(huán)的每一個環(huán)節(jié)，皮膚瘙癢是和心理壓力密切相關(guān)的心身疾病,長期以來給患者心理和身體兩方面帶來極大痛苦[6]。故從暢達情志，減輕心理壓力入手，可有效打斷此瘙癢搔抓心理壓力惡性循環(huán)，對瘙癢性疾病產(chǎn)生良好的治療作用[7-8]。

中醫(yī)學認為肝藏血，主疏泄，性喜條達而惡抑郁。若情志不遂，則肝氣郁結(jié)，郁久化熱，則血分受擾。肝主木，脾主土，木郁乘土，致脾虛濕邪不化，肝熱脾濕侵漬肌膚造成皮膚瘙癢、濕疹、皮炎等皮膚疾患[9]，治宜疏肝清熱健脾化濕[10]。丹梔逍遙散載于薛新甫的《內(nèi)科摘要》，具有疏肝解郁，健脾和營，兼清郁熱之功效，一直被歷代醫(yī)家遵循為治療肝郁化火證之經(jīng)典驗方。在現(xiàn)代中醫(yī)學研究中，丹梔逍遙散治療神經(jīng)性皮炎、慢性濕疹及老年性皮膚瘙癢等病療效顯著?，F(xiàn)代研究表明，丹梔逍遙散中柴胡、當歸、丹皮、梔子均具有抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用，可調(diào)節(jié)皮膚新陳代謝，解熱除煩涼血，引熱下行，對紅斑、瘙癢等皮膚炎癥性病變有較好的療效。尤其對伴有精神緊張，并以虛證為主的患者，特別是特應性皮炎以外的面部紅斑、濕疹性病變療效尤佳[11]。

本研究選取健康小鼠造模，可有效排除心理壓力以外因素對瘙癢癥狀的影響。結(jié)果顯示，治療后心理壓力+丹梔逍遙散組的搔抓次數(shù)顯著少于心理壓力組，說明丹梔逍遙散可有效改善心理壓力影響下的皮膚瘙癢癥。

眾所周知，組胺作為最常見的致癢介質(zhì)存在于人的嗜堿粒細胞和肥大細胞中。肥大細胞受到角質(zhì)形成細胞分泌的如細胞因子、胺類、神經(jīng)肽、神經(jīng)生長因子等內(nèi)源性致敏物質(zhì)后釋放組胺引起皮膚瘙癢，同時，肥大細胞也能刺激皮膚C-神經(jīng)纖維感受器致敏導致皮膚瘙癢。組胺與質(zhì)膜中的特異性受體(如H1R和H4R)結(jié)合，激活TRPV1，活化感覺神經(jīng)元內(nèi)的下游靶分子，包括G蛋白、磷脂酶C、磷脂酶A2、12-脂氧合酶，進而導致瘙癢[12]。本研究結(jié)果顯示，心理壓力+丹梔逍遙散組小鼠血漿組胺水平顯著低于心理壓力組，表明丹梔逍遙散可降低該模型小鼠的血漿組胺水平。前期研究以及本次研究都表明皮膚肥大細胞的數(shù)量或性質(zhì)可能會因長期暴露于應激刺激而改變，但是心理壓力+丹梔逍遙散組小鼠皮膚肥大細胞數(shù)量較其余兩組并無統(tǒng)計學差異，說明丹梔逍遙散并不能降低皮膚肥大細胞數(shù)量，然而丹梔逍遙散干預后血漿組胺水平顯著降低，表明丹梔逍遙散可能的作用機制為降低了肥大細胞分泌組胺的量，故可通過進一步的研究探尋丹梔逍遙散對肥大細胞及組胺分泌的更具體的作用。

且經(jīng)丹梔逍遙散治療后，該模型小鼠抑郁程度較心理壓力組顯著減輕，表明丹梔逍遙散對改善心理壓力帶來的抑郁狀態(tài)作用顯著。這提示了針對情緒心理的治療也是緩解心理壓力惡化的瘙癢的可能思路?，F(xiàn)代藥理研究顯示，丹梔逍遙散的成分提取物具有抗抑郁、抗焦慮的作用，可以有效地改善心理應激變化[13]。研究表明，丹梔逍遙散抗抑郁作用機制可能與調(diào)節(jié)下丘腦—垂體—腎上腺(the hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)軸相關(guān)，可抑制HPA軸的異?？簥^[14]。心理壓力可能導致HPA軸的改變，然改變情況可能與壓力類型等多種情況相關(guān)，作者此前的研究證實慢性心理壓力會導致HPA軸的損傷，血漿中皮質(zhì)酮分泌高峰延遲。故丹梔逍遙散改善慢性心理壓力惡化的瘙癢的作用機制可能與HPA軸的調(diào)節(jié)相關(guān)，但具體的作用機制有待進一步探究。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療后心理壓力+丹梔逍遙散組小鼠搔抓次數(shù)仍高于空白組，說明丹梔逍遙散僅對慢性心理壓力惡化的瘙癢有緩解作用，并不能完全治愈，這提示了丹梔逍遙散并不能對慢性心理壓力惡化的瘙癢的機制起阻斷作用?，F(xiàn)有研究已證實了瘙癢與心理壓力惡性循環(huán)的存在，瘙癢的發(fā)生與惡化主要與神經(jīng)傳導通路及致癢介質(zhì)相關(guān)，精神源性瘙癢亦是瘙癢發(fā)生的原因之一。作者前期研究證實心理壓力惡化的瘙癢可與皮膚組織中肥大細胞增多、血漿組胺水平上升及HPA軸的改變相關(guān)。近年來關(guān)于心理壓力與瘙癢的研究在神經(jīng)科學領(lǐng)域已取得顯著進展[15]。蘇鑫裕等[16]利用光遺傳學證實中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area，VTA)兩類神經(jīng)元分別在不同角度對瘙癢的感覺進行調(diào)控,即GABA能神經(jīng)元調(diào)控了瘙癢所帶來的厭惡情緒,而多巴胺能神經(jīng)元則調(diào)控了搔抓之后帶來的愉悅感，提示了瘙癢與心理壓力相關(guān)的腦科學相關(guān)機制。目前，降低焦慮的藥物和非藥物療法顯示了良好的止癢效果。著眼于情志，從肝論治皮膚瘙癢已是治療皮膚瘙癢的公認療法[17]。本文已證實丹梔逍遙散可通過控制組胺釋放，改善抑郁等機制來緩解慢性心理壓力惡化的皮膚瘙癢，而在神經(jīng)傳導通路、非組胺致癢介質(zhì)方面的相關(guān)機制上仍需進一步研究。

基于以上實驗結(jié)果，認為丹梔逍遙散可緩解慢性心理壓力影響下的小鼠的瘙癢癥狀，其可能的機制是控制了組胺的釋放及改善小鼠的抑郁狀態(tài)。