基于HPLC-ELSD法不同企業(yè)清熱解毒口服液中山銀花違規(guī)投料的研究與篩查

朱偉堃，王中如，牛紅霞，周欣

(菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東 菏澤 274000)

0 引言

清熱解毒口服液由石膏、金銀花、玄參等十二味中藥組成[1]，現(xiàn)收載于《中國藥典》2015年版一部。具清熱解毒之功效，用于熱毒壅盛所致的發(fā)熱面赤、煩躁口渴、咽喉腫痛；流感、上呼吸道感染見上述證候者。清熱解毒口服液生產(chǎn)廠家眾多，據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全國有211家生產(chǎn)企業(yè)。

清熱解毒口服液方中所用金銀花量較大，為134g每1000mL，與其同科植物山銀花，兩者長期混用[2,3]。《中國藥典》2005年版一部按照“一物一名”的原則將金銀花和山銀花明確區(qū)分為兩個(gè)品種[4]。兩者雖為近緣植物，但藥效與安全性不能一概而論[5-7]，李文沛等[8]發(fā)現(xiàn)與金銀花相比，高劑量山銀花灰氈毛忍冬會(huì)導(dǎo)致大鼠過敏。近年來，山銀花產(chǎn)量大價(jià)格低，而金銀花產(chǎn)量低價(jià)格高[9,10]，造成兩者在市場中混用的情況無法得到解決。價(jià)格的差異，可能會(huì)導(dǎo)致部分生產(chǎn)企業(yè)存在為降低成本而不按處方進(jìn)行投料的行為。兩者在藥材時(shí)相對(duì)較好區(qū)分[11]，但制成制劑后由于缺少方法，難以進(jìn)行區(qū)別。

本文以山銀花的特征成分灰氈毛忍冬皂苷乙[12,13]為指標(biāo)，建立了清熱解毒口服液中山銀花的篩查方法。筆者收集到了全國16家生產(chǎn)企業(yè)的42批次樣品，來自全國8個(gè)省份。通過建立的方法來評(píng)價(jià)和篩查各生產(chǎn)企業(yè)以山銀花摻混金銀花違規(guī)投料的情況。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260Ⅱ高效液相色譜儀-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(安捷倫科技有限公司)，超聲波清洗器(杭州超聲波有限公司)，十萬分之一電子天平(XS105型，METTLER TOLEDO)，超純水儀(默克密理博)。

1.2 試藥

灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品(批號(hào)：111814-201604，含量以94.4%計(jì))、金銀花對(duì)照藥材(批號(hào)：121060-201608)、山銀花對(duì)照藥材(批號(hào)：121595-201202)均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇(色譜純，默克公司)、乙腈(色譜純，默克公司)、D101型大孔吸附樹脂(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)

清熱解毒口服液樣品來自2020年山東省內(nèi)市場流通抽樣，具體樣品收集情況見表1。

表1 樣品收集情況

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18色譜柱 (4.6×250mm，5μm)，柱溫：30℃，流速1.0mL/min以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按表2進(jìn)行梯度洗脫。

表2 梯度洗脫表

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，漂移管溫度為60℃，霧化室溫度 50℃，氣體流速為 1.6L/min，進(jìn)樣量：對(duì)照品 5、20μl，供試品溶液 10μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品10.26mg置50mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1mL含灰氈毛忍冬皂苷乙0.1937mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品10mL，加在D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑為1.0cm，柱高為20cm)上，用水100mL洗脫，棄去水液，再用甲醇100mL洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶解至干(溫度低于60℃)，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖1 典型液相色譜圖

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

2.4 專屬性試驗(yàn)

2.4.1 對(duì)照藥材溶液的制備

分別稱取金銀花和山銀花對(duì)照藥材粉末0.5g，精密稱定，置50mL量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處30min，放冷，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為金銀花和山銀花對(duì)照藥材溶液。

2.4.2 山銀花陰性模擬樣品溶液的制備

取處方中所有藥味，按處方比例制成缺山銀花的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液的制備方法，制成山銀花陰性對(duì)照溶液。

2.4.3 山銀花陽性模擬樣品溶液的制備

取山銀花替代金銀花，處方中其他藥味按處方比例，制成山銀花陽性對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法，制成山銀花陽性對(duì)照溶液。

取上述金銀花和山銀花對(duì)照藥材溶液、山銀花陰性和陽性模擬樣品溶液及“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示金銀花對(duì)照藥材和山銀花陰性模擬樣品在與灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上未出現(xiàn)保留時(shí)間一致的色譜峰，表明制劑中處方的藥味及輔料對(duì)檢測(cè)結(jié)果無干擾。典型圖譜見圖1。

2.5 檢測(cè)限和定量限

精密量取對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋后注入液相色譜儀測(cè)定，以信噪比S/N=3時(shí)，此時(shí)的濃度為檢測(cè)限；以S/N=10時(shí)，此時(shí)的濃度為定量限?；覛置潭碥找业臋z測(cè)限為0.0194mg/mL，定量限為0.0388 mg/mL。

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取 2.1.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液各 3、5、10、15、20μl，注入液相色譜儀，分別測(cè)定峰面積。以灰氈毛忍冬皂苷乙進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1.253X+3.674，R2=0.999?；覛置潭碥找疫M(jìn)樣量在0.5811-3.8740μg之間，其自然對(duì)數(shù)與峰面積積分值自然對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系。

2.7 儀器精密度試驗(yàn)

精密吸取2.1.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液20μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，取灰氈毛忍冬皂苷乙峰面積的自然對(duì)數(shù)，RSD為0.52%，表明儀器精密度良好。

2.8 耐用性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，用Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)、Thermo C18(250mm×4.6mm，5μm)兩種色譜柱試驗(yàn)，結(jié)果一致。

2.9 樣品測(cè)定

根據(jù)灰氈毛忍冬皂苷乙的檢測(cè)限(0.0194mg/mL)，故建議規(guī)定清熱解毒口服液樣品中灰氈毛忍冬皂苷乙的含量不得過0.025mg/mL。按照上述建立的方法對(duì)抽檢的42批次清熱解毒口服液進(jìn)行檢測(cè)，有2家企業(yè)的4批次樣品檢出灰氈毛忍冬皂苷乙，且均超出定量限，具體結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表3，檢出灰氈毛忍冬皂苷乙樣品的典型色譜圖見圖1(F)。

3 討論

3.1 檢測(cè)條件的篩選

樣品處理時(shí)查閱有關(guān)文獻(xiàn)[14-15]，考察了直接稀釋進(jìn)樣、正丁醇萃取、D101型大孔吸附樹脂除雜等提取方法。直接稀釋進(jìn)樣時(shí)目標(biāo)峰附近雜峰較多，對(duì)于結(jié)果無法做出很好判斷；正丁醇萃取時(shí)易發(fā)生乳化，且正丁醇萃取液減壓干燥時(shí)間較長，不適合大批量處理。而大孔吸附樹脂處理，可克服上述兩種處理方法存在的困難。在流動(dòng)相選擇時(shí)，考察了乙腈-水，乙腈-0.4%冰醋酸溶液，乙腈-0.1%磷酸溶液等，最終選擇了乙腈-水作為流動(dòng)相，使得目標(biāo)峰與鄰近雜峰分離較好。

3.2 樣品測(cè)定

通過上述測(cè)定結(jié)果可知，有2家企業(yè)的4批次樣品檢出了山銀花特征成分灰氈毛忍冬皂苷乙，檢出率9.5%，說明部分企業(yè)為降低成本，涉嫌以山銀花摻混金銀花進(jìn)行違規(guī)投料，這對(duì)按處方進(jìn)行投料的生產(chǎn)企業(yè)存在一定的不正當(dāng)競爭。清熱解毒口服液中山銀花的違規(guī)使用問題仍不容樂觀，現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)不能有效控制企業(yè)的違規(guī)投料行為，增加清熱解毒口服液中山銀花檢查項(xiàng)尤為必要。

最后，建議企業(yè)就山銀花違規(guī)投料問題行自檢，規(guī)范生產(chǎn)，并加強(qiáng)從業(yè)人員的有關(guān)培訓(xùn)。建議增加清熱解毒口服液中山銀花的檢查項(xiàng)目，以提高產(chǎn)品的安全性。建議監(jiān)管部門加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)企業(yè)從原料到成品的檢查力度，提高企業(yè)的質(zhì)量意識(shí)和質(zhì)控水平，從而保障人民群眾的用藥安全。