硅膠吸附-交聯(lián)脂肪酶的研究

徐 然，韓生華，王利剛

(山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山西大同 037009)

脂肪酶(Lipase) 是重要的生物酶催化劑，也是重要的工業(yè)酶制劑，可參與催化含酯基結(jié)構(gòu)物質(zhì)的水解、合成以及交換等[1]。脂肪酶具有高效催化效率、溫和反應(yīng)條件、高度特異性以及較少副產(chǎn)物等諸多優(yōu)點(diǎn)[2]，越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用到能源、食品、醫(yī)藥以及日化等領(lǐng)域[3]。然而，游離狀態(tài)脂肪酶在催化過(guò)程中所存在的不穩(wěn)定性、不能分離與不能再利用等缺點(diǎn)，阻礙了脂肪酶的進(jìn)一步發(fā)展與應(yīng)用[4]。脂肪酶固定化技術(shù)解決了這些不足，正被越來(lái)越多的學(xué)者所研究[5]。

固定化脂肪酶技術(shù)是指采用某種物理或者化學(xué)的方法使脂肪酶被限制在專(zhuān)屬的區(qū)域內(nèi)發(fā)生催化反應(yīng)的技術(shù)[6]。常用的脂肪酶固定技術(shù)大致分為吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價(jià)結(jié)合法[7]。吸附法是由離子鍵、范德華力或者氫鍵等分子間力將脂肪酶吸附到相應(yīng)載體上，酶分子的活性結(jié)構(gòu)不易被改變，因此能保留較高的活性[8]。但脂肪酶在載體上吸附得不太牢固，在催化使用中容易脫離載體[9-10]。交聯(lián)法是指通過(guò)脂肪酶與載體或者脂肪酶與脂肪酶的中間形成共價(jià)鍵從而交織成一個(gè)結(jié)實(shí)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行固定化[11]，交聯(lián)法固定的酶穩(wěn)定性高。一般來(lái)說(shuō)，交聯(lián)法都是與其它方法一起使用，如吸附加交聯(lián)等，從而形成雙重固定化，使得酶活較高的同時(shí)也增加了穩(wěn)定性[12]。

本文考察了3 種固定方式對(duì)脂肪酶固定效果的影響，并對(duì)最優(yōu)固定方式中的關(guān)鍵條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為脂肪酶今后進(jìn)一步的應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

脂肪酶（酶活力：6.08×104μmol/g，實(shí)驗(yàn)室自制）；硅膠，青島海洋化工有限公司；橄欖油為化學(xué)純，無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、50%戊二醛、磷酸二氫鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、聚乙烯醇均為分析純，購(gòu)自天津康科德有限公司。

DF-101S 集熱式恒溫磁力攪拌器、SHZ-D 循環(huán)水式真空泵，常州市國(guó)華儀器有限責(zé)任公司；HH-2兩孔水浴鍋、KDM 電熱套，南京市桑力設(shè)備廠(chǎng)；SB-5200DTDN 超聲清洗機(jī)，泰州市力航實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；MA200 電子天平，上海志榮科技有限公司；101AB-1電熱鼓風(fēng)干燥箱，蘇州納美瑞電子有限公司。

1.2 載體處理

稱(chēng)量硅膠20 g，加入60 mL 的18.5%的鹽酸水溶液，于60 ℃的水浴中回流6 h，之后抽真空過(guò)濾。濾得的固體使用去離子水清洗多次直至中性，然后110 ℃條件下干燥12 h，即為活化的硅膠。

1.3 固定方法的選擇

（1）單吸附8 h：稱(chēng)取活化硅膠0.5 g，分別加入0.1 mol/L 的pH 為7.5 的磷酸緩沖液5 mL，及濃度為3 mg/mL 的脂肪酶溶液5 mL，于室溫下反應(yīng)8 h 后抽真空過(guò)濾，分別收集并測(cè)定游離酶、濾液和回收的固定酶的酶活，計(jì)算酶活回收率。

（2）吸附6 h后加戊二醛交聯(lián)2 h：上述（1）中室溫吸附6 h之后繼續(xù)加入適宜濃度的戊二醛攪拌2 h，之后抽真空過(guò)濾，分別收集并測(cè)定濾液和固定酶的酶活，計(jì)算酶活回收率。

（3）吸附交聯(lián)8 h：上述（1）中在加入磷酸緩沖液和酶液后直接加入戊二醛交聯(lián)劑室溫?cái)嚢? h，計(jì)算酶活回收率。

1.4 脂肪酶活力測(cè)定方法

采用橄欖油乳化法測(cè)定。酶活：在40 ℃、pH 為8.0磷酸溶液環(huán)境中，每克脂肪酶每1 min催化乳化劑所生成的脂肪酸的量（μmol）。

分別取pH 為8.0 的0.1 mol/L 磷酸緩沖液4.0 mL和乳化劑5.0 mL 加入到標(biāo)簽為樣品a、樣品b 和空白c 3 個(gè)瓶子內(nèi)，于40 ℃保溫5.0 min 后，將1.0 mL 待測(cè)酶溶液加入到樣品a、b瓶?jī)?nèi)催化10.0 min。之后同時(shí)向a、b、c 中各加入20.0 mL 無(wú)水乙醇終止反應(yīng)。分別滴加幾滴酚酞，用NaOH 滴定水解出來(lái)的脂肪酸，當(dāng)反應(yīng)體系變微紅時(shí)，記錄反應(yīng)的NaOH的量。

脂肪酶活力=[ (a+b)÷2-c ]×N×F÷t

式中：a、b—樣品a、b 分別反應(yīng)的NaOH 體積量，c—空白c 反應(yīng)的NaOH 體積量，N—NaOH 濃度，F(xiàn)—稀釋倍數(shù)，t—時(shí)間（min）。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定方法的選擇

3種方法的固定結(jié)果對(duì)比見(jiàn)表1。

表1 固定方法的選擇

由表1 可以看出最佳的固定方法為：吸附6 h 后加戊二醛交聯(lián)2 h。這種方法是先通過(guò)吸附法將脂肪酶吸附固定在已活化的硅膠載體上，進(jìn)而通過(guò)交聯(lián)法在吸附了脂肪酶的硅膠外圍進(jìn)行交聯(lián)，即進(jìn)行雙重的固定，因此具有較好的酶活回收率。僅僅使用吸附法固定后的脂肪酶較不穩(wěn)固，在反應(yīng)中較易脫落。而吸附交聯(lián)法同時(shí)進(jìn)行，可能又使得脂肪酶分子與分子之間相互纏繞交聯(lián)，影響其在硅膠載體上的充分固定。因此選取先吸附再交聯(lián)的方式對(duì)目標(biāo)酶進(jìn)行固定。

2.2 優(yōu)化脂肪酶的固定條件

2.2.1 優(yōu)化給酶量

用pH 為7.5的0.1 mol/L 磷酸緩沖液配制濃度分別為1、3、5、7、9 mg/mL 的脂肪酶液，并以此進(jìn)行給酶量?jī)?yōu)化。給酶量影響固定反應(yīng)的結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 給酶量的優(yōu)化

當(dāng)體系中加入1 mg/mL 給酶量，此時(shí)酶活回收率處于較低值。當(dāng)體系中加入3 mg/mL 給酶量，酶活回收率達(dá)到最高，達(dá)19.0%。繼續(xù)增大給酶量，酶活回收率顯現(xiàn)降落趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)榛罨墓枘z載體的量是一定的，其所能固定的脂肪酶的量也是一定的。當(dāng)固定到載體上的脂肪酶達(dá)最大狀態(tài)后，再增加脂肪酶則不會(huì)提高最終產(chǎn)物的量，反而會(huì)因?yàn)槊概c酶之間發(fā)生團(tuán)聚影響最終固定產(chǎn)物的活性，所以圖中曲線(xiàn)先升后降最后趨近平緩。

2.2.2 優(yōu)化固定溫度

在3 mg/mL 給酶量下，將反應(yīng)體系分別放到0、10、20、30、40、50 ℃的水浴中進(jìn)行固定溫度的優(yōu)化。溫度影響固定反應(yīng)的結(jié)果如圖2。

圖2 優(yōu)化固定溫度

隨著固定溫度的增高，酶活回收率也在慢慢增大，當(dāng)固定溫度控制在30 ℃時(shí)，其回收率最高，達(dá)28.3%。繼續(xù)增高溫度，酶活回收率呈現(xiàn)下降現(xiàn)象。其原因是，脂肪酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度對(duì)蛋白質(zhì)的影響極為重要，溫度過(guò)高會(huì)使蛋白質(zhì)活性發(fā)生改變，而溫度太低則抑制反應(yīng)速度。因此過(guò)高或者過(guò)低的溫度都會(huì)影響其最終的回收率。

2.2.3 優(yōu)化固定時(shí)間

在3 mg/mL給酶量以及30 ℃下，選擇1、2、4、6以及8 h進(jìn)行固定反應(yīng)中吸附反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化，見(jiàn)圖3。

圖3 優(yōu)化吸附時(shí)間

吸附反應(yīng)時(shí)間為6 h 時(shí)，得到的回收率為34.2%，到達(dá)最高。進(jìn)一步延長(zhǎng)吸附時(shí)間，酶活回收率表現(xiàn)出下降的結(jié)果。吸附反應(yīng)時(shí)間如果太短，脂肪酶分子還未在硅膠載體上徹底吸附。而隨著吸附時(shí)間的加長(zhǎng)，曲線(xiàn)呈下降趨勢(shì)，是因?yàn)楣潭ㄟ^(guò)程中進(jìn)行的吸附過(guò)程主要是靠分子間作用力來(lái)完成的，隨著時(shí)間的增加吸附在載體上的脂肪酶在不斷攪拌過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)脫落的現(xiàn)象，因此脂肪酶的固定量減少了。而且長(zhǎng)時(shí)間的攪拌也會(huì)造成脂肪酶分子的部分失活，酶活回收率也因此降低。

2.2.4 優(yōu)化固定pH值

在3 mg/mL 給酶量、30 ℃以及吸附6 h 條件下，配制pH 依次是5.5、6.5、7.0、7.5、8.0 以及8.5 的磷酸緩沖液，并以此進(jìn)行酸堿度的優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 優(yōu)化固定pH

在pH小于7.5時(shí)，增加pH值，其酶活的回收率也會(huì)隨之變大。當(dāng)pH 為7.5 時(shí)，酶活回收率最高達(dá)40.5%。進(jìn)一步增大pH 值，則會(huì)降低酶活回收率。酸堿環(huán)境對(duì)該酶的影響極大，pH 值的不同會(huì)改變其微觀(guān)結(jié)構(gòu)，從而改變酶的特性，過(guò)酸或者過(guò)堿的環(huán)境都能使酶的微觀(guān)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，這樣就會(huì)使脂肪酶發(fā)生活性的改變。pH值還可以改變脂肪酶所催化的底物的離解狀態(tài)，進(jìn)而改變脂肪酶與底物的相互接觸和催化作用。因此，酶活回收率在過(guò)酸過(guò)堿條件下均會(huì)顯示出大大降低的結(jié)果。

2.2.5 優(yōu)化戊二醛的濃度

在3 mg/mL 給酶量、30 ℃、吸附6 h 以及pH 值為7.5 的條件下，配制濃度分別為0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1%的戊二醛水溶液，并以此進(jìn)行戊二醛濃度的優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 優(yōu)化戊二醛濃度

戊二醛的濃度為0.1%時(shí)，酶活回收率測(cè)得43%，為最高。當(dāng)濃度低于0.1%時(shí)，由于其濃度太低，提供的固定位點(diǎn)較少，導(dǎo)致交聯(lián)效果不好，因此脂肪酶的固定效果不佳。而當(dāng)其濃度持續(xù)增大，酶活回收率卻一直下降，這可能是由于隨著濃度的增大，戊二醛除了會(huì)與載體上吸附的脂肪酶交聯(lián)還會(huì)與反應(yīng)體系中存在的游離脂肪酶交聯(lián)，從而導(dǎo)致脂肪酶在載體上的固定量降低，并且戊二醛是有毒化學(xué)試劑，濃度太大會(huì)使得脂肪酶變性失活，從而大大影響酶活回收率。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 重復(fù)使用性

分析游離狀態(tài)的脂肪酶與固定后的脂肪酶的重復(fù)使用性，結(jié)果如圖6。由于游離狀態(tài)的脂肪酶分子粒徑太小無(wú)法回收，因此無(wú)重復(fù)使用性。而固定之后的脂肪酶在進(jìn)行6 次循環(huán)使用后，還有45.54 %的初始酶活。

圖6 固定化脂肪酶的重復(fù)使用性

2.3.2 室溫保存性

在每天同一時(shí)間點(diǎn)分別測(cè)定游離狀態(tài)和固定狀態(tài)的脂肪酶室溫下的酶活力。隨著儲(chǔ)存時(shí)間增加，酶活力都會(huì)慢慢降低。因此好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性會(huì)增加其工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。由圖7可以看出，固定狀態(tài)的脂肪酶比游離狀態(tài)的具有更高的穩(wěn)定性，10d后仍有33.12%的初始酶活。

圖7 脂肪酶的室溫保存性

3 結(jié)論

利用活化處理后的硅膠作載體，實(shí)驗(yàn)室自制脂肪酶（脂肪酶活力：6.08×104μmol/g）為樣品酶，通過(guò)3種方法進(jìn)行脂肪酶的固定，得出先吸附后交聯(lián)的方法固定脂肪酶的效果最好。進(jìn)一步優(yōu)化固定過(guò)程中的各個(gè)因素，最后得到其最優(yōu)固定條件是：給酶量3 mg/mL，固定溫度30 ℃，吸附反應(yīng)時(shí)間6 h，pH 為7.5，戊二醛為0.1%。在該最優(yōu)條件下所得到的固定酶活回收率為43%。且固定之后的脂肪酶獲得了重復(fù)使用性及較好的室溫保存性。將脂肪酶進(jìn)行固定后，不僅降低了游離脂肪酶的使用成本，而且擴(kuò)寬了其今后工業(yè)化應(yīng)用的道路。