甘草酸對高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細胞T G F-β1/S m ads信號通路的影響

冉 喆，王玉軍，王 珍，趙天琪，侯紹章

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，銀川 750004）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，國際糖尿病聯(lián)盟組織近日調(diào)查顯示，在我國有20%～40%的糖尿病患者并發(fā)DN[1]。與系膜細胞增殖相關(guān)的細胞外基質(zhì)（extracelluar matrix，ECM）積聚是DN的主要病理變化之一，在DN病變初期，活化的腎小球系膜細胞即發(fā)生增殖，并分泌大量細胞因子影響ECM合成、分解平衡，逐漸引起ECM大量沉積，導(dǎo)致腎小球硬化、腎纖維化的形成[2-3]。因此，對腎小球系膜細胞功能的監(jiān)測在糖尿病腎病的早期診斷和治療中具有重要意義。在眾多影響腎纖維化的信號通路中，轉(zhuǎn)化因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smads信號通路是誘導(dǎo)腎纖維化進程中最重要的信號通路[4]，高糖刺激可以導(dǎo)致腎小球系膜細胞TGF-β1表達增加，引起下游受體調(diào)節(jié)Smads（R-Smads）的激活，進而增加ECM相關(guān)蛋白的表達，并抑制ECM的降解，導(dǎo)致腎臟纖維化[5]。因此，通過阻斷TGF-β1-Smads信號通路可以有效預(yù)防DN的進展。近年來，甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）在抗腎纖維化及DN保護領(lǐng)域取得了長足進展，得到了廣大學(xué)者的認(rèn)可。Hou等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠模型中，GA可以通過抑制氧化應(yīng)激對DN起防治作用。GA也可以通過提高Mn-SOD的表達減緩高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷[7]。然而，GA對于高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞的影響及其作用機制尚未明確。因此，本實驗通過高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞模擬體內(nèi)環(huán)境，觀察GA對TGF-β1-Smads信號通路蛋白表達的影響，以探討GA對DN腎臟保護作用機制，為GA在商業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用和推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

MCs SV40 MES13細胞購自武漢普羅塞爾公司（中國），胰蛋白酶EDTA（鈣二鈉）、胎牛血清（FBS）購自Hyclone實驗室公司（美國），D-葡萄糖粉末購自Sigma（美國），BCA蛋白測定試劑盒購自上海碧云天生物工程研究所（中國）。6 cm皿、24孔細胞培養(yǎng)器、96孔細胞培養(yǎng)器和吸管均購自NEST GROUP公司（中國），GA購自北京索萊寶公司（中國），CCK-8試劑盒購自同仁化學(xué)研究所（日本）?？筎GF-β1來自Abcam公司（美國），抗P-Smad3、P-Smad2、COLⅠ、COLⅣ購自Affinity Biosciences（中國）。ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司（中國）。分光光度儀購自BioTek（美國），聚偏氟乙烯膜（PVDF）購自Millipore公司（美國），BSA購自中山金橋（中國），F(xiàn)ITC（異硫氰酸熒光素）-共軛二級抗體購自Abbkine（中國）。凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-RAD公司（美國）。奧林巴斯FV1000激光掃描共焦顯微鏡購自奧林巴斯（美國）。

1.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組

將MCs SV40 MES13細胞放在DMEM（Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基）中培養(yǎng)，并添加10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100μg·mL-1鏈霉素（37℃、5%CO2）孵育17 h。然后將細胞分為低糖對照（NG）組（5.6 mmol·L-1葡萄糖）、高糖（HG）組（30 mmol·L-1葡萄糖）和高糖GA（HG+GA）組（30 mmol·L-1葡萄糖+200μmol·L-1GA），分別培養(yǎng)48 h。

1.3 CCK-8法檢測細胞活性

將細胞密度調(diào)整為5×104個/mL后接種于96孔板中，每孔100μL。在37℃溫箱培育17 h待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后，進行分組干預(yù)48 h。每孔分別加入10μL CCK-8，在37℃溫箱避光孵育2 h后使用分光光度儀在495 nm處測量光密度（OD）值。

1.4 HE染色觀察細胞形態(tài)

將1.5×104個細胞接種在玻璃片上，在37℃溫箱中培育17 h，待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后，進行分組干預(yù)48 h。干預(yù)結(jié)束后，將各組細胞依次用75%乙醇固定、蘇木精-伊紅染色，再采用光學(xué)顯微鏡來觀察細胞密度和基本形態(tài)。

1.5 Western blot檢測細胞中TGF-β1、P-Smad3、P-Smad2、COLⅠ、COLⅣ的表達

干預(yù)48 h后，用冷磷酸鹽緩沖液洗滌細胞3次，冰上裂解提取全蛋白。BCA法檢測蛋白濃度，然后將蛋白重新分裝。將蛋白質(zhì)提取物從十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜（PVDF）上，然后進行一抗孵育，抗TGF-β1（1∶500）、抗P-Smad3（1∶1000）、抗P-Smad2（1∶1000）、抗-COLⅠ、COLⅣ、抗GADPH（1∶5000）4℃過夜，次日，二抗常溫孵育，在暗視野中使用ECL發(fā)光液，采用凝膠成像系統(tǒng)對信號進行定量，從而測定TGF-β1、P-Smad3、P-Smad2、COLⅠ、COLⅣ蛋白的相對表達量。

1.6 細胞免疫熒光檢測P-Smad3、COLⅠ、COLⅣ的表達

將細胞在玻璃蓋上培養(yǎng)，待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后進行分組處理48 h。48 h后采用4.0%多聚甲醛進行細胞固定。用PBS洗滌3次，0.1%TritonX-100處理20 min，在室溫下用10%BSA封閉1 h，在4℃下與抗P-Smad3（1∶400）、抗COLⅠ、COLⅣ孵育過夜。次日，在常溫下與FITC（異硫氰酸熒光素）-共軛二級抗體（1∶250）常溫避光孵育。DAPI封片，并在400倍鏡下隨機選取5個視野采圖。用Image J軟件測定相對熒光強度，并取平均值。實驗重復(fù)3次后進行了統(tǒng)計分析。用激光掃描共焦顯微鏡對細胞內(nèi)P-Smad3、COLⅠ、COLⅣ蛋白表達位置以及熒光強度進行觀察。

1.7 ELISA法檢測細胞上清液中COLⅠ、COLⅣ的分泌情況

將細胞以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，待17 h細胞狀態(tài)穩(wěn)定后，分組干預(yù)細胞48 h。48 h后收集各組細胞的上清液，在4℃下以1500×g離心20 min并按ELISA試劑盒說明書進行實驗，在450 nm波長處測定各孔的光密度（OD）值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GA對高糖誘導(dǎo)的MCs細胞活性的影響

本實驗采用CCK-8法檢測各組細胞的活性，與NG組（0.850±0.036）比較，HG組（1.47±0.130）細胞活性升高（P＜0.01）；與HG組比較，HG+GA組（0.966±0.086）細胞活性降低（P＜0.05）。

2.2 GA對高糖誘導(dǎo)的MCs細胞形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示，NG組MCs呈現(xiàn)梭形，膜完整性良好，細胞核形態(tài)規(guī)則。HG組細胞密度明顯增大，部分細胞體積顯著增加，細胞呈現(xiàn)長梭形，出現(xiàn)纖維化趨勢，表現(xiàn)出損傷特征。與HG組相比HG+GA組細胞形態(tài)有一定程度的改善，見圖1。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察甘草酸對高糖作用下MCs形態(tài)學(xué)影響（HE×400）

2.3 GA對高糖誘導(dǎo)的MCs上清液中COLⅠ、COLⅣ分泌的影響

采用ELISA法檢測各組細胞COLⅠ、COLⅣ分泌情況。如表1所示，與NG組相比，HG組細胞分泌COLⅠ、COLⅣ表達均增高（P均＜0.01）。與HG組相比，HG+GA組細胞分泌COLⅠ、COLⅣ含量均下降（P均＜0.05）。

表1 GA對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞ECM分泌的影響（n=3，±s，ng·mL-1）

表1 GA對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞ECM分泌的影響（n=3，±s，ng·mL-1）

與NG組相比##P＜0.01；與HG組相比**P＜0.01。

?

2.4 GA對高糖誘導(dǎo)的MCs內(nèi)TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、COLⅠ、COLⅣ蛋白表達的影響

采用Western blot法對各組細胞TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、COLⅠ、COLⅣ的表達含量進行檢測。與NG組相比，HG組COLⅠ、COLⅣ表達均升高（P均＜0.01）。與HG組相比，HG+GA組COLⅠ、COLⅣ表達量均降低（P均＜0.01）。與NG組相比，HG組TGF-β1表達水平升高（P＜0.01），與HG組相比，HG+GA組TGF-β1表達水平降低（P＜0.05）。與NG組相比，HG組P-Smad2、PSmad3水平均升高（P均＜0.05）。與HG組相比，HG+GA組P-Smad2、P-Smad3水平均降低（P均＜0.05），見圖2。

2.5 GA對高糖誘導(dǎo)的MCs細胞P-Smad3、COLⅠ、COLⅣ熒光強度的影響

與NG組相比，HG組細胞核內(nèi)P-Smad3表達增高，熒光強度增強（P＜0.01），出現(xiàn)了明顯的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。與HG組相比，HG+GA組細胞核內(nèi)P-Smad3表達降低（P＜0.01），熒光強度減弱。COLⅠ、COLⅣ主要表達于細胞質(zhì)中，與NG組相比，HG組細胞內(nèi)COLⅠ、COLⅣ熒光強度均增高（P均＜0.01）；與HG組相比，HG+GA組COLⅠ、COLⅣ熒光強度均減弱，即COLⅠ、COLⅣ蛋白表達量下降（P均＜0.05），見圖3，與Western blot、ELISA檢測結(jié)果一致。

3 討論

目前對DN以降血糖藥物與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑為主要治療方案，但該療法成本高，副作用大，療程長[8]。所以探討DN的發(fā)病機制，尋找有效的天然早期抗糖尿病藥物已成為當(dāng)下對于DN治療研究的重點。GA是三萜皂苷，是豆科灌木甘草（glycyrhiza glabra）植物根提取物的主要生物活性成分[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[10]，GA可以有效延緩DN的進展，但其具體機制還有待于進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)GA可以有效抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細胞的活性。組織病理學(xué)觀察，相比于正常組，高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞出現(xiàn)排列紊亂，細胞形態(tài)偏細長，胞漿和細胞核變暗以及細胞密度增大等現(xiàn)象，而在GA干預(yù)后高糖誘導(dǎo)的細胞在形態(tài)上得到了有效的改善，表明GA可以對高糖誘導(dǎo)的系膜細胞起到保護作用。Western blot和ELISA方法檢測結(jié)果顯示，GA可有效抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞纖維化因子的表達，證實GA對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞纖維化有明顯的抑制作用。

TGF-β1-Smads信號通路與多種纖維化疾病的發(fā)生及發(fā)展息息相關(guān)[11]，而且在DN的各個惡化進程中也起到關(guān)鍵性作用[12]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，在DN患者的腎臟中TGF-β1因子的表達量增多，從而促進系膜基質(zhì)外基質(zhì)的合成并抑制其降解，導(dǎo)致腎小球的纖維化[13]。研究表明[14]，Smads蛋白是TGF-β1的直接下游因子，介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化過程。TGF-β1通過與其受體的結(jié)合會導(dǎo)致Smad2和Smad3蛋白的磷酸化，該磷酸化后的蛋白會與Smad4結(jié)合形成低聚復(fù)合物，然后進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用，激活ECM的啟動因子[15]。因此，抑制TGF-β1因子以及P-Smad2和P-Smad3蛋白的表達量對調(diào)節(jié)ECM的表達有重要意義。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GA高糖共培養(yǎng)組的腎小球系膜細胞TGF-β1和P-Smad2、3表達較高糖組降低，提示GA抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞ECM的產(chǎn)生，延緩DN腎纖維化進程的作用機制可能與調(diào)控TGF-β1-Smads信號通路密切相關(guān)。

圖2 Western blot檢測MCs細胞TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、COLⅠ、COLⅣ蛋白的表達情況

綜上，GA抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜ECM的合成與TGF-β1-Smads信號通路有關(guān)，本實驗結(jié)果可以為GA藥物在DN治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供技術(shù)支持，但其具體的作用機制還有待于進一步的研究。

圖3 免疫熒光檢測MCs中P-Smad3、COLⅠ、COLⅣ表達情況