枸杞多糖對四氯化碳致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用

伍智慧，冉喆，張睛睛，王玉軍，侯紹章

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，銀川 750004；2.寧夏糖尿病及其并發(fā)癥基礎(chǔ)和臨床研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，銀川 750004）

肝臟是人體合成代謝的重要器官，在調(diào)節(jié)消化排泄、營養(yǎng)物質(zhì)儲存、代謝平衡、解毒等生理功能方面發(fā)揮著重要作用。由于個體差異性和基礎(chǔ)狀況的復(fù)雜性，人們在進(jìn)行各種藥物對癥治療的同時(shí)，各種藥物所引起的不良反應(yīng)未能引起重視，結(jié)果導(dǎo)致各臟器功能障礙也隨之逐漸出現(xiàn)[1-3]。藥物本身和（或）代謝產(chǎn)物引起的肝臟損害，是臨床上多見且嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)，因此采取有效措施預(yù)防和治療肝損害已成為亟待解決的問題。研究顯示，肝臟疾病治療過程中多糖類化合物對其具有一定的保護(hù)作用[4-6]。枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharides，LBP）是枸杞子的主要有效成分，由阿拉伯多糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖共同組成的一類大分子水溶性多糖，研究顯示其具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力等多種生理作用[7]。Keich樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白（Keich-like ECH-associated protein 1，Keap1）/核因子E2相關(guān)蛋白（necular factor erythroid 2-related factor，Nrf2）在維持細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)中扮演著重要角色[8]。胃癌組織中Keap1、IKKβ表達(dá)異常，提示Keap1可能通過IKKβ對NF-kB信號通路的影響在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中具有一定作用[9]。IKKβ/NF-kB信號通路被稱之為經(jīng)典的炎性反應(yīng)信號通路，參與各類疾病的炎癥反應(yīng)，但Keap1和IKKβ/NF-kB兩者在急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程中是否存在關(guān)聯(lián)目前未見報(bào)道。因此本研究采用四氯化碳（CCl4）一次性腹腔注射誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷，治療組給予不同劑量的枸杞多糖溶液進(jìn)行干預(yù)，探討枸杞多糖對急性肝損傷是否具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用是否與Keap1/IKKβ/NF-kB抗炎信號通路有關(guān)，以便為急性肝損傷的治療方案中藥物的使用提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

LBP（純度90%，寧夏啟元藥業(yè)有限公司），由寧夏醫(yī)科大學(xué)李光華老師課題組惠贈。CCl4（純度≥99.0%，上海麥克林生物科技有限公司）。AST、ALT、TNF-α、IL-1β和IL-6檢測試劑盒（上海江萊實(shí)業(yè)股份有限公司）。兔抗Keap1、IKKβ和NF-kB單克隆抗體（Cell Signaling Technology公司），鼠抗GAPDH單抗（Abways Technology公司），BCA蛋白含量檢測試劑盒和SDSPAGE凝膠試劑盒（南京凱基生物技術(shù)公司）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑（Takara）（武漢塞維爾有限科技公司），引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PVDF膜（0.45μm）（Thermo Fisher Scientific公司）。酶標(biāo)儀（美國Thermo Electron公司），低溫高速離心機(jī)（美國Thermo Electron公司），化學(xué)發(fā)光成像分析儀（美國GE公司），顯微鏡（日本OLYMPUS公司），石蠟切片機(jī)（美國Thermo Electron公司），垂直電泳儀，轉(zhuǎn)印儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性肝損傷模型制備 ICR小鼠40只，體質(zhì)量28～32 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供［SCXK（寧）2015-0001］。所有小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（55±15）%的清潔級動物實(shí)驗(yàn)中心，每日光照-黑暗周期12 h∶12 h。實(shí)驗(yàn)前所有小鼠在動物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)1周，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，每組8只：正常對照組、模型組、LBP低劑量組（100 mg·kg-1）、LBP中劑量組（200 mg·kg-1）和LBP高劑量組（400 mg·kg-1）。LBP用生理鹽水溶解為對應(yīng)藥物濃度，各組小鼠灌胃給藥0.5 mL各對應(yīng)濃度的LBP溶液，正常對照組和模型組灌胃等劑量生理鹽水0.5 mL，每天1次，持續(xù)7 d。末次給藥后1 h，除正常對照組小鼠腹腔注射等劑量花生油外，其余各組小鼠一次性腹腔注射CCl4食用花生油溶液（濃度為0.1%，10 mg·kg-1）誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷。造模16 h時(shí)所有小鼠禁飲禁食，24 h時(shí)先摘取眼球采血制備血清，然后頸椎脫臼致死后取肝臟組織，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次，稱重后一半作常規(guī)固定包埋，制成蠟塊備用，另一半-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠肝臟指數(shù)變化 造模后24 h眼球取血，取血前稱取小鼠體質(zhì)量，取血后小鼠頸椎脫臼致死取肝臟并稱重以計(jì)算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=肝臟重量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%。

1.2.3 小鼠肝組織病理學(xué)觀察 取各組小鼠相同部位肝臟組織，置于4%多聚甲醛浸泡固定24 h，脫水透明，石蠟包埋，切片。蘇木素-伊紅（HE）染色，200倍光鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)變化。

1.2.4 小鼠血清肝功能指標(biāo)及炎癥因子檢測 眼球取血室溫凝固1～2 h，4℃冰箱過夜，待自然血清析出后，低溫高速（4℃，15000 r·min-1）離心10 min，分離至備用干凈離心管中。按照ELISA檢測試劑盒說明書在室溫下操作，檢測肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及炎性指標(biāo)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素6（IL-6）表達(dá)水平。

1.2.5 qRT-PCR法檢測小鼠肝組織Keap1、IKKβ、NF-kB的mRNA表達(dá) 取100 mg肝臟組織加入勻漿管中，嚴(yán)格按照試劑盒說明采用Trizol方法從肝臟組織中提取Keap1、IKKβ、NF-kB全RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：94℃10 min，94℃30 s，56℃40 s，72℃40 s，循環(huán)40次，收集數(shù)據(jù)進(jìn)行熔解曲線分析。反應(yīng)結(jié)束后以2-ΔΔCT方法計(jì)算目的基因相對內(nèi)參GAPDH的相對表達(dá)水平，重復(fù)該實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6 Western blot檢測小鼠肝組織Keap1、IKKβ、NF-kB蛋白的表達(dá) 從-80℃冰箱取出凍存肝臟組織，取各組小鼠相同部位組織約100 mg，剪成小塊，加入蛋白裂解液1 mL，冰上混勻研磨10 min/次，重復(fù)3次。裂解后組織勻漿低溫高速（4℃，15000 r·min-1）離心10 min，取上清于備用干凈離心管置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用BCA蛋白定量法定量蛋白并分裝（40μg·μL-1），100℃使蛋白變性，保存-80℃冰箱。配制10%分離膠，灌入分離膠至2/3位置處，用水封膠，室溫靜置10 min后倒掉水，用濾紙吸干殘留水分后加入濃縮膠插入1.0梳子，室溫靜置30 min后拔掉梳子蛋白上樣10μL/30μg。電泳穩(wěn)壓100 V，待溴酚藍(lán)至分離膠底端時(shí)停止電泳；轉(zhuǎn)模280 mA，100 min。轉(zhuǎn)模結(jié)束，用1×TBST洗膜液洗膜5 min/次，重復(fù)3次；5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉2 h后用1×TBST洗膜液洗膜5 min/次，重復(fù)3次；加一抗Keap1、IKKβ、NF-kB于抗體孵育盒4℃過夜，次日取出室溫復(fù)溫1 h，回收一抗，TBST洗膜液洗膜3次，每次5 min；加二抗，在室溫?fù)u床1 h后再用1×TBST洗膜液洗膜3次，每次5 min，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像曝光條帶。采用Image J軟件進(jìn)行分析計(jì)算灰度值（靶蛋白灰度值/GAPDH灰度值）。

表1 Keap1、IKKβ、NF-kB的引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝濕重、體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠肝濕重增加、體質(zhì)量下降、肝臟指數(shù)升高（P＜0.05或＜0.01）。與模型組相比，LBP低劑量組和中劑量組肝濕重、體質(zhì)量和肝臟指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），高劑量組肝濕重下降、體質(zhì)量增加、肝指數(shù)下降（P＜0.05或＜0.01），見表2。

2.2 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響

正常對照組肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列。模型組肝小葉和肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂不規(guī)則，有不同程度性水腫，呈空泡樣變性，部分有炎細(xì)胞浸潤。與模型組相比，LBP低劑量組、中劑量組和高劑量組有不同程度減輕，并隨藥物劑量的增加改善程度愈加明顯，細(xì)胞排列趨于正常，細(xì)胞水腫逐漸減輕，空泡樣改變逐漸消失，炎細(xì)胞浸潤逐漸減少，見圖1。

表2 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝濕重、體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

圖1 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織病理形態(tài)的影響（HE×200）

2.3 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠血清生化指標(biāo)和炎性因子水平的影響

與正常對照組相比，模型組ALT、AST、TNFα、IL-1β、IL-6水平均升高（P均＜0.01）。與模型組相比，LBP低劑量組IL-1β水平降低（P＜0.01），其余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；LBP中劑量組僅ALT水平無明顯變化，AST、TNF-α、IL-1β、IL-6均降低（P均＜0.01）；高劑量組AST、ALT、TNF-α、IL-1β、IL-6均降低（P均＜0.01），見圖2。

2.4 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織Keap1、IKKβ、NF-kB mRNA表達(dá)的影響

與對照組相比，模型組Keap1mRNA的表達(dá)降低（P＜0.01），而IKKβ和NF-kBmRNA表達(dá)均升高（P均＜0.01）。與模型組相比，低劑量組Keap1、IKKβ和NF-kBmRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；中劑量組和高劑量組Keap1mRNA表達(dá)均升高（P均＜0.01），而IKKβ和NF-kBmRNA的表達(dá)均降低（P均＜0.01），見圖3。

2.5 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織Keap1、IKKβ、NF-kB蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組相比，模型組Keap1蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），IKKβ蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），NF-kB蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。與模型組相比，高劑量組Keap1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；LBP中劑量組和高劑量組IKKβ和NF-kB蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），見圖4。

3 討論

圖2 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST、TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平的影響

圖3 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織Keap1、IKKβ、NF-kB mRNA表達(dá)的影響

圖4 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織Keap1、IKKβ、NF-kB蛋白表達(dá)的影響

肝臟損傷的動物模型復(fù)制途徑包括化學(xué)性、免疫性、生物性、酒精性等方法。CCl4長期以來由于其誘導(dǎo)的動物模型所表現(xiàn)的癥狀、肝功能檢查指標(biāo)以及病理學(xué)變化與人體肝損傷十分相似而被廣泛使用。該方法操作簡單，重復(fù)性好而被認(rèn)為是經(jīng)典的肝損傷模型，常用來進(jìn)行保肝藥物的篩選。由于肝臟屬于再生組織，具有強(qiáng)大的組織修復(fù)能力，因此造模過程中給藥劑量和用藥時(shí)間不同可引起急性肝損傷、慢性肝損傷和肝纖維化等不同實(shí)驗(yàn)所需要的動物模型[10]。本實(shí)驗(yàn)遂采取CCl4食用花生油溶液（濃度為0.1%）0.1 mL/10 g一次性腹腔注射誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷。血清生化指標(biāo)ALT和AST是存在于胞漿內(nèi)的兩種可溶性酶，是判斷肝功能受損的重要指標(biāo)。肝細(xì)胞經(jīng)CCl4損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，ALT和AST由胞質(zhì)釋放到胞外，血清含量升高，在一定程度上反映了肝臟損傷的嚴(yán)重程度。

目前，急性肝損傷的發(fā)病機(jī)制主要與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有著密切關(guān)系。LBP是從我國傳統(tǒng)名貴藥材枸杞中提取的主要有效成分，保肝作用是LBP目前研究比較廣泛的一面，主要是通過降低肝臟受損狀態(tài)下氧化應(yīng)激水平來實(shí)現(xiàn)的[11]。急性肝損傷時(shí)，肝臟會產(chǎn)生一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)，作為機(jī)體最大的巨噬細(xì)胞庫，又稱肝庫普弗細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞）分泌大量的炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等參與肝損傷的發(fā)生過程。TNF-a是肝巨噬細(xì)胞受損時(shí)釋放最早的炎性細(xì)胞因子；IL-1β作為體內(nèi)最強(qiáng)的炎性因子，是TNF-α級聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物，又是免疫炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；IL-6是重要的淋巴因子，通過激活調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，參與免疫反應(yīng)，當(dāng)它們過度表達(dá)時(shí)介導(dǎo)炎性因子趨化作用加劇瀑布樣炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織損傷[12]。核因子-kB（nuclear factor-kB，NF-kB）是免疫炎癥反應(yīng)過程中經(jīng)典的炎性因子，靜息狀態(tài)NF-kB與其抑制因子（inhibitor of nuclear factors-kB，Ikβ）相結(jié)合形成復(fù)合物，使NFkB滯留在細(xì)胞質(zhì)中處于非活化狀態(tài)呈現(xiàn)低表達(dá)水平。核轉(zhuǎn)錄因子-kβ抑制蛋白激酶（inhibitor of nuclear factors-kB kinase，IKK）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合體，由IKKα、IKKβ、IKKγ3個亞基組成，其中IKKβ具有絲氨酸蛋白激酶活性，是NF-kB上游重要的調(diào)節(jié)激酶[13]。肝細(xì)胞經(jīng)CCl4損傷時(shí)，白細(xì)胞介素作為一種重要的炎性介質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子，使IKK被激活，IkB蛋白降解，NFkB與IkB解離，NF-kB隨即由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至胞核內(nèi)與特異性啟動子結(jié)合，介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子在細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞之間相互表達(dá)，多向調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，引起炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大效應(yīng)[14-15]。

Keap1又稱胞漿肌動蛋白伴侶分子，通過泛素連接酶E3與靶蛋白特異性結(jié)合促使靶蛋白泛素化降解，Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄因子，在胞質(zhì)中與Keap1結(jié)合，被Keap1負(fù)性調(diào)控[8]。相關(guān)研究表明IKKβ與Keap1相互作用類似于Nrf2，可以直接作用于IKKβ，調(diào)控NF-kB信號通路[16-17]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，小鼠經(jīng)CCl4誘導(dǎo)的模型組ALT和AST活性升高，Keap1表達(dá)降低，IKKβ、NF-kB、TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)升高；與模型組相比，LBP低劑量對模型組的損傷基本無明顯改善，中劑量組和高劑量組ALT和AST活性降低，Keap1表達(dá)升高，IKKβ、NFkB、TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)降低。

綜上所述，LBP可有效改善CCl4致小鼠急性肝損傷的損傷程度，降低炎性因子的表達(dá)，對CCl4致急性肝損傷小鼠具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與增強(qiáng)Keap1活性，降低IKKβ/NF-kB信號通路活性有關(guān)。