Ang1-7通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕高血壓大鼠心肌肥厚

戴亞東，丁奕瑤，馬全萍，燕 茹，于 欣，楊 震

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏海原縣人民醫(yī)院心內(nèi)科，海原 755200；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心臟中心實驗室，銀川 750004；4.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心臟中心，銀川 750004）

長期高血壓會引起左心室心肌肥厚，最終導(dǎo)致心室功能的下降甚至心衰[1]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin angiotensin-aldosterone system，RAAS）是機體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓和水電解質(zhì)平衡的重要系統(tǒng)，ACE2-Ang1-7-Mas軸是一條與經(jīng)典升壓通路ACE-AngⅡ-AT1相互對抗的RAAS系統(tǒng)新旁路。Ferreira等[2]研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）和AT1受體（AT1R）拮抗劑的藥理學(xué)效應(yīng)可能與Ang（1-7）相同。有研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，ACEI可以通過阻滯AngⅡ的產(chǎn)生而降低血壓及逆轉(zhuǎn)心肌肥厚，并可通過抗氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）保護心肌細胞。研究[5-6]證實ERS引起的心肌細胞凋亡可能在心肌肥厚、心力衰竭和心肌梗死中發(fā)揮重要作用。但血管緊張素1-7（angiotensin1-7，Ang1-7）能否通過抑制ERS減輕心肌肥厚這一機制尚有待證實，因此本研究采用自發(fā)性高血壓大鼠模型，觀察Ang1-7對自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertension rat，SHR）血壓、左室肥厚及心肌細胞ERS相關(guān)因子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）和C/EBP同源蛋白質(zhì)（CHOP）表達的影響，探討其與心肌肥厚的關(guān)系，為Ang1-7防治心血管疾病提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Ang1-7（5 mL/支，美國Med ChemExpress公司）；Alzet微型滲透壓泵（2 mL，美國Alzet公司）；兔抗大鼠GRP78抗體和兔抗大鼠CHOP抗體（Gene Tex公司）；無創(chuàng)鼠尾動脈血壓儀（上海卡爾文公司）；小動物超聲成像系統(tǒng)（Vevo2100，富士VisualSonics公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 實驗動物與分組處理

實驗所用的SHR和Wistar-kyoto（WKY）大鼠均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證書：SCXK（京）2016-0006，WKY大鼠是SHR常用的血壓正常的對照組品系。所有的大鼠均飼養(yǎng)在寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心標準的SPF級的屏障系統(tǒng)里，采用普通大鼠飼料飼養(yǎng)。所有實驗動物處理符合實驗守則和寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利與倫理委員（IACUC）的要求，所有手術(shù)于麻醉狀態(tài)下進行。

購買16周齡WKY大鼠5只和SHR 15只，分別測量收縮壓（systolic blood pressure，SBP）及舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）。選擇SBP＞140 mmHg，DBP＞90 mmHg的SHR 10只，隨機分為藥物干預(yù)組（Ang1-7+SHR，AS）和安慰劑對照組（normal+SHR，NS），WKY大鼠作正常對照組（normal control，NC），共3組。AS組按400 ng·（kg·min）-1的劑量皮下Alzet微滲泵連續(xù)注射Ang1-7，持續(xù)給藥4周；NS組按相同容積泵速皮下微滲泵注射0.9%NaCl，持續(xù)給藥4周；NC組不做任何處理。于干預(yù)結(jié)束后測量3組大鼠血壓，行超聲心動圖檢查后處死全部大鼠并留取心臟標本。

1.3 指標檢測

1.3.1 各組大鼠血壓值的測量 使用卡爾文鼠尾動脈血壓儀尾套法測量各組大鼠干預(yù)前16周齡和干預(yù)后20周齡時的血壓水平。每只大鼠測量3次取血壓平均值，每次測量間隔10 min以上，分別記錄SBP及DBP。

1.3.2 超聲心動圖檢查 藥物干預(yù)4周后，使用小動物超聲成像系統(tǒng)檢測大鼠心臟肥厚程度和功能。檢查時將大鼠麻醉，四肢固定在手術(shù)臺上，在胸部左側(cè)放置探針進行M型成像測量并記錄；連續(xù)采樣至少5個心動周期，重復(fù)采樣3次。測量參數(shù)包括舒張期后壁厚度（diastolic posterior wall，PWd）、收縮期后壁厚度（systolic posterior wall，PWs）和舒張期室間隔厚度（diastolic interventricular septum，IVSd）、收縮期室間隔厚度（systolic interventricular septum，IVSs）、左心室質(zhì)量（left ventricular mass，LVM）以及左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening）。LVM依照公式計算：LVM=1.04×［（LVEDd+PWd+IVSd）3-LVEDd3］。功能參數(shù)短軸縮短率（FS）按公式計算：FS=100%×（LVEDd-LVEDs）/LVEDd。［LVEd為左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter）；LVEDs為左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter］。

1.3.3 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察心肌細胞形態(tài) 大鼠經(jīng)異氟烷吸入麻醉后沿劍突開胸取其心臟，置于培養(yǎng)皿中，生理鹽水洗滌3次后用多聚甲醛固定，脫水后行石蠟包埋，將心臟組織石蠟塊切片，厚度5μm，備用。切片經(jīng)脫蠟、水化后，蘇木素浸染3 min，水洗5 min，1%的鹽酸乙醇分化5 s，水洗，0.5%伊紅染2 min，流水快速沖洗、脫水、透明、封片固定，光鏡下觀察心肌細胞形態(tài)。

1.3.4 Masson染色觀察心肌細胞膠原纖維 心臟組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化后，蘇木素染色6 min，自來水沖洗至變藍色，鹽酸乙醇分化5 s，水洗，麗春紅品紅溶液染6 min，蒸餾水沖洗，磷鉬酸溶液、苯胺藍分別染5 min，乙醇處理1 min，脫水、透明后，中性樹膠封片，每個切片在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色，并隨機選取3個視野拍照。

1.3.5 免疫組化檢測各組大鼠心肌組織中GRP78及CHOP蛋白的表達 將心肌組織的石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化后，用檸檬酸鹽洗沖液在高溫高壓連續(xù)噴氣5 min進行抗原修復(fù)，待自然冷卻后PBS洗滌3次，各3 min，擦干后3%H2O2室溫下封閉20 min，室溫下山羊血清封閉30 min，滴加1∶300稀釋兔抗大鼠GRP78一抗孵育（4℃過夜）。復(fù)溫30 min后PBS洗滌，加一滴聚合物增強劑（室溫孵育20 min），滴加1∶500稀釋羊抗兔IgG（室溫孵育20 min），滴加新鮮DAB顯色，復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片，鏡下觀察結(jié)果，測定平均光密度（AOD）值，并進行定量分析。CHOP兔抗大鼠一抗兔二抗稀釋比例及測定步驟同GRP78。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗，干預(yù)前后比較采用配對t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ang1-7對大鼠血壓的影響

大鼠干預(yù)前16周齡時，NS組、AS組大鼠SBP和DBP均高于NC組（P均＜0.01）。藥物干預(yù)后20周齡時，NS、AS組大鼠的SBP及DBP均高于NC組（P均＜0.01）；AS組SBP與DBP水平均低于NS組（P均＜0.01）。NS組大鼠20周齡時SBP與DBP水平與16周齡時差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）；AS組大鼠20周齡時SBP、DBP均低于16周齡時（P均＜0.01），見表1。

表1 3組大鼠血壓的比較（±s，mmHg）

表1 3組大鼠血壓的比較（±s，mmHg）

與16周齡相比*P＜0.01；與NC組相比#P＜0.01；與NS組相比▲P＜0.01。

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2.2 Ang1-7對大鼠心肌肥厚和左室功能的影響

圖1為藥物干預(yù)4周后行超聲心動圖檢查獲取的M型圖像。干預(yù)后，NS組大鼠PWd、PWs、IVSd、IVSs及LVM均高于NC組（P均＜0.05）；AS組大鼠PWd、PWs、IVSd、IVSs及LVM均低于NS組（P均＜0.05）。而FS各組大鼠間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

圖1 左心室的M型超聲圖像

表2 4周后3組大鼠左心室超聲心動圖檢測指標比較（±s）

表2 4周后3組大鼠左心室超聲心動圖檢測指標比較（±s）

與NC組相比*P＜0.05；與NS組相比#P＜0.05。

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2.3 Ang1-7對大鼠心肌細胞形態(tài)學(xué)的影響

HE染色顯示，NS組心肌細胞較NC組心肌細胞明顯肥大，給予Ang1-7干預(yù)后，AS組的心肌細胞較NS組明顯纖細，較為接近NC組，見圖2。

圖2 各組大鼠心肌細胞形態(tài)學(xué)的變化（HE×400）

2.4 Ang1-7對大鼠心肌組織膠原纖維的影響

NC組大鼠心肌細胞（呈紅色）形態(tài)規(guī)則，間質(zhì)輕微纖維化（呈藍色）；NS組大鼠心肌排列紊亂，發(fā)生明顯纖維化；給予Ang1-7干預(yù)后，AS組大鼠心肌組織排列規(guī)則，相比NS模型組膠原纖維分布減少，見圖3。

圖3 各組大鼠心肌細胞膠原纖維的比較（Masson染色×400）

2.5 Ang1-7對大鼠心肌細胞GRP78和CHOP蛋白表達的影響

NS組大鼠心肌細胞GRP78和CHOP的表達主要定位于心肌細胞胞質(zhì)中，染色呈棕黃色，見圖4；NS組心肌細胞GRP78、CHOP蛋白均較NC組增多（P均＜0.01）；與NS組比較，AS組心肌細胞中GRP78和CHOP相對蛋白表達量均減少（P均＜0.01），見表3。

圖4 各組大鼠心肌組織中GRP78、CHOP蛋白的表達（免疫組化×400；↑：胞質(zhì)中GRP78和CHOP蛋白高表達）

表3 Ang1-7對大鼠心肌細胞GRP78和CHOP蛋白表達的影響（±s）

表3 Ang1-7對大鼠心肌細胞GRP78和CHOP蛋白表達的影響（±s）

與NC組相比*P＜0.01；與NS組相比#P＜0.05。

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3 討論

心臟對壓力負荷非常敏感，長期高血壓可致左心室肥厚和重構(gòu)。SHR是具有自發(fā)性發(fā)生高血壓特征的大鼠，被廣泛選擇作為人類心肌肥厚研究的理想動物模型[7]。本研究結(jié)果顯示，Ang1-7干預(yù)組的SHR血壓水平及室間隔厚度、左心室質(zhì)量等指標均低于未干預(yù)組，提示Ang1-7干預(yù)可降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓，減輕壓力負荷并在一定程度上逆轉(zhuǎn)左室肥厚。Ang1-7有多條降壓途徑，其中通過ACE2/Ang1-7拮抗AngⅡ的作用最為重要。Kuczeriszka等[8]研究表明，通過AngⅡ灌注建立的高血壓模型中，Ang1-7缺失導(dǎo)致水鈉潴留增加，血壓升高，而Ang1-7能夠通過血管緊張素受體1（AT1）介導(dǎo)糾正AngⅡ的上述作用，阻止血壓升高。

本文同時觀察了SHR心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子GRP78、CHOP的表達及Ang1-7對它們的影響，以探討其與心肌肥厚的關(guān)系。結(jié)果顯示高血壓大鼠ERS信號分子GRP78和CHOP的表達均增加，經(jīng)Ang1-7干預(yù)后，兩因子在心肌組織的表達顯著降低，GRP78表達的上調(diào)是迄今為止公認的ERS激活的標志[9]，而CHOP是ERS凋亡的標志[10]，表明SHR所致的肥厚心肌存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，且Ang1-7可以抑制上述改變，從而對心肌組織起到有效的保護作用，使心肌組織受損程度降低。該作用可能是通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)從而起到逆轉(zhuǎn)心肌肥厚的作用，推測這可能是Ang1-7減輕心肌肥厚的一個機制，這與周玉榮等[11]研究結(jié)果一致。也有研究表明[12]，AT1受體（AT1R）拮抗劑-纈沙坦通過特異性阻斷AngⅡ與AT1受體的結(jié)合，消除AngⅡ?qū)ρ獕汉托墓δ艿挠绊?，抑制SHR心肌細胞ERS激活，減輕心肌細胞凋亡而發(fā)揮心臟保護作用。提示Ang1-7通過抑制SHR心肌細胞ERS減輕心肌肥厚所致的心肌損傷。

綜上所述，Ang1-7能顯著降低SHR血壓水平，并可通過抑制ERS減弱左心室肥厚，使肥厚心肌細胞受損程度有所減輕并好轉(zhuǎn)。Ang1-7因?qū)π难芫哂辛己玫谋Ｗo作用目前已經(jīng)獲得廣泛關(guān)注，本文從分子水平上討論了該藥物對心肌組織的可能保護途徑，為心肌肥厚的研究提供了新的思路。