‘綠寶石’梨果實(shí)發(fā)育期酚類物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化及其抗氧化活性

王鑫，姜喜，于軍,2，蒲云峰，林彩霞，吳翠云,2*

(1塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院/南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300)

(2塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300)

(3塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

(4新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 鐵門關(guān) 841005)

酚類物質(zhì)是植物的主要次生代謝產(chǎn)物之一，參與植物的生長(zhǎng)繁殖過程，協(xié)助植物抗逆，抵抗天敵侵害[1]。酚類物質(zhì)對(duì)人體也有著一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]，在防病保健方面，具有抗腫瘤、抗氧化、防治心腦血管疾病以及抗菌等作用[3]。

近年來，對(duì)水果內(nèi)酚類物質(zhì)的研究已成為熱點(diǎn)。對(duì)梨果實(shí)內(nèi)酚類物質(zhì)的研究已有相關(guān)的報(bào)道，研究表明，梨果實(shí)中主要包括羥基肉桂酸、羥基醌、黃烷醇、黃酮醇等酚類物質(zhì)；其中綠原酸、熊果苷、兒茶素、表兒茶素、蘆丁是梨中主要的酚類單體化合物[4]。LONG Z等[5]在梨皮中鑒定出36種黃酮和19種羥基肉桂酸酯，主要酚類物質(zhì)是熊果苷和綠原酸，其余酚類物質(zhì)品種間差別很大。不同品種梨果實(shí)中酚類物質(zhì)含量也有差別。曾少敏等[6]研究發(fā)現(xiàn)不同梨系統(tǒng)間總酚、總黃酮含量存在顯著差異，表現(xiàn)為秋子梨最高，西洋梨略低，新疆梨、白梨次之，砂梨最低。梨果實(shí)中酚類物質(zhì)及含量的分布也有一定的規(guī)律。李靜等[7]、張小雙等[8]研究表明：梨果實(shí)中果皮部位酚類物質(zhì)含量最高，果心次之，果肉中最低。李凡等[9]對(duì)梨中主要的酚類物質(zhì)熊果苷在果實(shí)中的含量與分布進(jìn)行研究，結(jié)果表明5個(gè)品種中的含量均為果皮＞果心＞果肉；其中果肉中的熊果苷分布也表現(xiàn)出靠近果皮和果心的含量大于中部的含量。安景舒等[10]、郭杰[11]、曾少敏等[6]的研究中均表明梨果實(shí)中酚類物質(zhì)均具有一定的抗氧化活性，且不同品種間的抗氧化活性有所不同?！G寶石’梨又名‘中梨一號(hào)’為優(yōu)良早熟新品種，口感細(xì)膩脆爽，豐產(chǎn)，連續(xù)結(jié)實(shí)能力強(qiáng)，具有較好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[12]。本試驗(yàn)以‘綠寶石’梨果實(shí)為試材，采用超聲波輔助甲醇提取法及自由基清除法對(duì)果實(shí)發(fā)育期內(nèi)總酚、總黃酮、酚類組分含量和抗氧化能力的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行檢測(cè)，旨在揭示‘綠寶石’梨果實(shí)發(fā)育過程中酚類物質(zhì)及抗氧化能力變化規(guī)律，為梨的功能性物質(zhì)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘綠寶石’梨果實(shí)樣品采自輪臺(tái)梨種質(zhì)資源圃，于2019年5月25日（花后50 d）開始采樣，每隔14 d采樣一次，采摘時(shí)隨機(jī)選取樹冠外圍、中部不同方向，無病蟲害，大小一致的果實(shí)，每棵樹10個(gè)，三次重復(fù)。采后立即放入4℃采樣箱中運(yùn)回，帶皮切片去核后保存于-70℃超低溫冰箱中待測(cè)。

TU-1800型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；1510酶標(biāo)儀、374酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher ROTINA 380R；LC-20A液相色譜，日本島津。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

梨果實(shí)樣品從超低溫冰箱取出后，立即放入溫度為-50℃的真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥72 h，得到的凍干樣品用組織破碎機(jī)粉碎，于-20℃貯藏待測(cè)。

1.2.2 酚類物質(zhì)的提取

精確稱取1.000 0 g果實(shí)樣品凍干粉，用80%的甲醇溶解定容到25 mL容量瓶中，超聲波提取30 min后4 500 r/min離心15 min，將離心后的上清液貯藏在-20℃的條件下備用。

1.2.3 主要活性物質(zhì)的測(cè)定

總酚的測(cè)定參考Folin-Ciocalteu法[13]，以每g干樣所含沒食子酸的量表示，單位為mg GAE/g DW?？傸S酮的測(cè)定采用硝酸鋁比色法，以每g干樣所含蘆丁的量表示，單位為mg RE/g DW。

1.2.4 酚類組分測(cè)定

采用高效液相色譜法（HPLC）[13]，色譜條件：C18（250 mm×4.6 mm，5μm）柱，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min，流動(dòng)相A為0.5%甲醇水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。樣品中的酚類物質(zhì)含量以μg/g DW表示。

1.2.5 抗氧化能力的測(cè)定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除能力參考PU Y等[13]的方法。用6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，結(jié)果以μmol TE/g DW表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖，運(yùn)用DPS 7.5軟件進(jìn)行 Duncan’s多重比較（P＜0.05）和Pearson相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘綠寶石’梨果實(shí)發(fā)育期總多酚、總黃酮含量的變化

‘綠寶石’梨果實(shí)發(fā)育期總酚、總黃酮含量變化（如圖1、圖2所示），在‘綠寶石’梨生長(zhǎng)發(fā)育期，總酚、總黃酮含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在花后50～65 d降低的最顯著。在花后50 d時(shí)，總酚、總黃酮含量最高，分別達(dá)18.95 mg GAE/g DW、34.48 mg RE/g DW。隨果實(shí)的生長(zhǎng)總酚、總黃酮含量急劇下降，至花后65 d，果實(shí)中的總酚含量下降了70.66%?；ê?5～140 d果實(shí)中總酚含量變化差異不明顯，均在3.28～2.11 mg GAE/g DW范圍內(nèi)變化。至果實(shí)成熟時(shí)，果實(shí)內(nèi)總酚含量最低，為2.11 mg GAE/g DW，僅有花后50 d時(shí)的11.13%；果實(shí)內(nèi)總黃酮的含量變化趨勢(shì)與總酚含量一致，花后50 d時(shí)總黃酮含量是成熟時(shí)的12.54倍，花后80 d便下降到一個(gè)較低的水平，其含量在2.75～5.77 mg RE/g DW之間。

圖1 ‘綠寶石’梨果實(shí)發(fā)育期內(nèi)總酚含量的變化

圖2 ‘綠寶石’梨果實(shí)發(fā)育期內(nèi)總黃酮含量變化

2.2 ‘綠寶石’梨果實(shí)發(fā)育期內(nèi)酚類物質(zhì)組分分析

用HPLC法共鑒定出14種酚類物質(zhì)，分別為熊果苷、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、山萘酚-己糖-雙脫氧己糖苷、蘆丁、山萘酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮葡萄糖苷、槲皮素鼠李糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山萘酚-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、山萘酚-3-乙?；咸烟擒?、異鼠李素-3-乙酰基己糖苷。從表1可以看出，整個(gè)生育期中熊果苷的平均含量最高，達(dá)4 214.82 μg/g DW，占總組分的55.72%；綠原酸次之，平均含量為1 656.58 μg/g DW，占總組分的28.10%；兒茶素、表兒茶素的平均含量分別為213.62 μg/g DW、188.04 μg/g DW，占總組分的 3.07%、2.95%；其余酚類物質(zhì)含量較少，含量在5.34～99.41 μg/g DW間，各占比在1%左右。異鼠李素-3-乙?；禾擒蘸瑑H存在于果實(shí)發(fā)育初期，在花后95 d之后該物質(zhì)檢測(cè)不到。因此熊果苷、綠原酸是‘綠寶石’梨酚類物質(zhì)的主要組成成分。

表1 ‘綠寶石’梨果實(shí)發(fā)育期內(nèi)各酚類組分含量變化 單位：μg/gDW

在‘綠寶石’梨整個(gè)生育周期中，酚類物質(zhì)各組分含量呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，大體可分兩種，一種持續(xù)下降，直至果實(shí)成熟降至最低。此類物質(zhì)分別為熊果苷、兒茶素、綠原酸和異鼠李素-3-乙?；禾擒眨浜烤诨ê?0 d最高，成熟后含量最低。另一種中期降至最低，此類酚類組分均表現(xiàn)出在花后95 d含量最低，此時(shí)的含量與成熟時(shí)相近甚至低于成熟期。

2.3 ‘綠寶石’梨果實(shí)發(fā)育過程中體外抗氧化活性的動(dòng)態(tài)變化

‘綠寶石’梨果實(shí)在發(fā)育過程中抗氧化活性的變化影響如圖3所示。在果實(shí)發(fā)育的過程中，對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除能力均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。在花后50 d‘綠寶石’梨對(duì)自由基的清除能力最強(qiáng)；隨著果實(shí)發(fā)育對(duì)自由基的清除能力迅速下降。在成熟后對(duì)自由基的清除力降至最低。

圖3 ‘綠寶石’梨果實(shí)發(fā)育過程中抗氧化活性的變化

‘綠寶石’梨果實(shí)在發(fā)育過程中對(duì)不同的自由基的清除能力也不同，對(duì)DPPH自由基的清除能力低于ABTS。在花后50 d對(duì)ABTS的清除能力是DPPH的5.99倍，對(duì)ABTS的清除能力可達(dá)446.14 μmol TE/g，但對(duì)DPPH的清除能力僅有74.47 μmol TE/g。在花后50～65 d是‘綠寶石’梨果實(shí)抗氧化性最高的時(shí)期。

2.4 ‘綠寶石’梨果實(shí)發(fā)育期內(nèi)酚類物質(zhì)與抗氧化活性相關(guān)分析

‘綠寶石’梨果實(shí)發(fā)育過程中，酚類物質(zhì)含量與抗氧化性之間的相關(guān)性如表2所示。總酚、總黃酮、熊果苷、綠原酸、表兒茶素、山萘酚-己糖-雙脫氧己糖苷、槲皮葡萄糖苷、山萘酚-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-乙?；禾擒蘸繉?duì)ABTS、DPPH的清除能力均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（P＜0.01），異鼠李素-3-O-葡萄糖苷的含量對(duì)DPPH的清除能力呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，兒茶素、槲皮素鼠李糖苷的含量對(duì)ABTS的清除能力呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。蘆丁、山萘酚3-乙?；咸烟擒盏暮颗cDPPH、ABTS清除能力無相關(guān)性。從相關(guān)性分析可以看出總酚和黃酮是‘綠寶石’梨抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中綠原酸在對(duì)DPPH自由基的清除中起著較為重要的作用。表兒茶素、槲皮葡萄糖苷是對(duì)ABTS自由基的清除中的主要貢獻(xiàn)者。

表2 ‘綠寶石’梨果實(shí)發(fā)育期酚類物質(zhì)與抗氧化性之間的相關(guān)性

3 討論

酚類物質(zhì)可以參與植物生殖，協(xié)助其抗逆[1]，各類植物在不同的時(shí)期表現(xiàn)出不同的積累含量。植物在果實(shí)發(fā)育前期積累大量的酚類物質(zhì)有利于幼果抵抗高溫、蟲害、干旱等脅迫壓力，使果實(shí)得以成熟，順利完成繁殖過程[14]?！G寶石’梨果實(shí)發(fā)育過程中主要的酚類物質(zhì)是熊果苷和綠原酸，這與CUI T等[15]對(duì)鴨梨的研究相吻合。酚類物質(zhì)的含量隨著果實(shí)的成熟而降低，這與趙金偉等[16]對(duì)蘋果梨生育期酚類物質(zhì)變化的研究結(jié)果相一致。對(duì)于果實(shí)中酚類物質(zhì)含量隨著成熟而降低，王思新等[17]認(rèn)為果重的增加是導(dǎo)致酚類物質(zhì)下降的主要原因之一；果實(shí)內(nèi)酚類物質(zhì)的下降也是抗氧化性降低的主要原因?！G寶石’梨在果實(shí)發(fā)育期的抗氧化性同獼猴桃[18]、棗[19]等研究相一致，均表現(xiàn)為在幼果期抗氧化性較高，隨著果實(shí)成熟而逐漸降低。

黃酮類化合物又稱類黃酮、黃酮體等，廣泛存在于植物的各個(gè)器官中，是其產(chǎn)生的一類次生代謝物[20]?！G寶石’梨果實(shí)發(fā)育的過程中黃酮類物質(zhì)含量的變化與陳洪強(qiáng)等[21]對(duì)葡萄生長(zhǎng)發(fā)育中類黃酮含量的變化一致；研究表明幼果期和果實(shí)成熟后期是黃酮類化合物的主要積累期，果實(shí)發(fā)育初期果實(shí)生長(zhǎng)較快，黃酮類化合物伴隨著果實(shí)細(xì)胞大量分裂和強(qiáng)烈的新陳代謝迅速積累；成熟期黃酮類化合物含量低于幼果期，分析原因是細(xì)胞內(nèi)含水量比較高；對(duì)于在‘綠寶石’梨果實(shí)發(fā)育期兒茶素的含量變化與趙金偉等[16]對(duì)蘋果梨的研究結(jié)果有所不同：蘋果梨在果實(shí)發(fā)育期兒茶素的含量呈現(xiàn)出了低-高-低的趨勢(shì)，即幼果期和成熟期含量較低，發(fā)育中期含量增高，而‘綠寶石’梨則表現(xiàn)出持續(xù)降低的趨勢(shì)。目前清除自由基是評(píng)價(jià)抗氧化能力的基礎(chǔ)方法[22]，趙金偉等[23]用熊果苷和綠原酸純品進(jìn)行抗氧化能力對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明熊果苷的清除能力低于綠原酸，這與本研究中熊果苷抗氧化性能力相關(guān)性低于綠原酸結(jié)論吻合。GALVIS A C等[24]的研究結(jié)果認(rèn)為抗氧化性不是由單一的酚類組分決定的，對(duì)自由基的清除可能是酚類物質(zhì)間協(xié)同作用的結(jié)果。本研究中在抗氧化活性物質(zhì)也僅考慮了酚類和黃酮類物質(zhì)對(duì)抗氧化活性的影響，對(duì)于‘綠寶石’梨的抗氧化作用，還需要進(jìn)一步進(jìn)行探究。

4 結(jié)論

‘綠寶石’梨在果實(shí)發(fā)育期內(nèi)總酚、總黃酮的含量呈下降的趨勢(shì)，以花后50 d的含量最高，在成熟的過程中前期下降迅速，后期下降緩慢，逐漸趨于平穩(wěn)。熊果苷、綠原酸是‘綠寶石’梨果實(shí)中的主要酚類物質(zhì)；對(duì)于DPPH、ABTS自由基的清除能力也隨著果實(shí)的成熟呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在幼果期顯著高于成熟期。綠原酸、表兒茶素、槲皮葡萄糖苷是在抗氧化過程中比較重要的酚類組分，‘綠寶石’梨具有很好的抗氧化性。