高效液相色譜法測定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的方法驗證

郝果 王琳帆 安曉娟

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉是常用的食品添加劑，也是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標。苯甲酸、山梨酸具有防腐保鮮的作用，糖精鈉是合成甜味劑，甜度比蔗糖甜300-500倍。GB2760-2016《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》對這三者的添加范圍和限量都有明確的規(guī)定，超范圍或者超限量使用都是違法的。GB5009.28-2016《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》對其檢測方法做了規(guī)定，有高效液相色譜法和高效氣相色譜法，其中高效液相色譜法為第一法仲裁法被廣泛應用。國標方法在使用前要進行方法驗證，核查實驗室能否滿足檢測方法的要求。本研究針對高效液相色譜法測定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的適用性、線性、檢出限、定量限、加標回收率等進行了一一驗證，均能夠滿足檢測方法的要求。

一、儀器與試劑

1.儀器。高效液相色譜儀（紫外檢測器，Y001），島津LC-20AT；電子分析天平（Y033），BSA623S-CW，d=0.001g。

2.試劑。苯甲酸鈉標準品（唯一性標識3422003，純度100.0%），北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；山梨酸標準品（唯一性標識3192003，純度99.9%），北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；糖精鈉標準品（唯一性標識3212005，純度99.5%），北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；甲醇（色譜級），Aigma-Aldrich；乙酸銨（色譜級），aladdin；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅（分析純），天津市天力化學試劑有限公司；實驗室用水為自制超純水。

二、實驗與方法

1.色譜條件。（1）色譜柱：Diamonsil Plus 5um C18，250×4.6mm；檢測波長230nm；進樣量10uL。（2）流動相：甲醇+乙酸銨溶液（0.02mol/L）=5+95；流速1mL/min。

2.樣品前處理。準確稱取約2g（精確到0.001g）試樣于50mL具塞離心管中，加水約25mL，渦旋混勻，于50℃水浴超聲20min。冷卻至室溫后加入92g/L的亞鐵氰化鉀溶液2mL和183g/L的乙酸鋅溶液2mL，混勻，于8000r/min離心5min。將水相轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，在殘渣中加水20mL，渦旋混勻后超聲5min，于8000r/min離心5min。將水相轉(zhuǎn)移至同一50mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。取適量上清液過0.22um濾膜，待液相色譜測定。

3.標準溶液配制。（1）苯甲酸、山梨酸、糖精鈉（以糖精計）標準儲備液（1000mg/L）：分別準確稱取苯甲酸鈉0.118g、山梨酸0.134g、糖精鈉0.117g，用水溶解并定容至100mL，山梨酸用甲醇溶解定容。糖精鈉含結(jié)晶水，使用前需在120℃條件下烘4h，再在干燥器中冷卻至室溫后備用。（2）苯甲酸、山梨酸、糖精鈉（以糖精計）混合標準中間液（200mg/L）：分別準確吸取苯甲酸、山梨酸、糖精鈉（以糖精計）標準儲備液各10mL，于50mL容量瓶中用水定容。

4.標準工作溶液的配制。線性指在適當?shù)臐舛确秶鷥?nèi)，測定響應值與試樣中被測物質(zhì)濃度成比例關系的程度。用同一對照品儲備液經(jīng)精密稀釋，或者分別精密稱取對照品，制備一系列對照品溶液的方法進行測定，至少制備5份不同濃度的對照品溶液。根據(jù)測得的響應信號對被測物的濃度作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進行線性回歸。分別準確吸取苯甲酸、山梨酸和糖精鈉混合標準中間溶液0mL、0.05mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL和10.0mL，用水定容至10mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0mg/L、1.00mg/L、5.00mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、50.0mg/L、100mg/L和200mg/L的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉（以糖精計）混合標準系列工作溶液。以濃度對數(shù)為橫坐標、以峰面積為縱坐標制作標準曲線，即y=kx+b。

5.檢出限和定量限。檢出限是指試樣中被測物能被檢出的最低量，定量限是指試樣中被測物能被定量測定的最低量。一般驗證是通過添加標準說明的檢出限和定量限的標準物，然后進行測定，結(jié)果和標準給出的檢出限和定量限差別在20%以內(nèi)即認為符合要求。本實驗通過添加檢出限為0.005g/kg、定量限為0.01g/kg的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉，按照上述方法測定，并計算測定值和給出值的標準差。

6.精密度實驗。精密度是指在規(guī)定條件下，同一份均勻供試品經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度，一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差來表示。在規(guī)定的范圍內(nèi)，取同一濃度的供試品，用至少測定6次的結(jié)果進行評價。本實驗采用相對標準偏差來評價實驗的準確性，精密度越小，平行性越好，準確度相對越高。將濃度為0.005g/ kg、0.01g/kg、1.25g/kg的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標準溶液重復測定7次，計算測定值的相對標準偏差和變異系數(shù)，評價其重復性。

7.加標回收實驗。加標回收實驗是化學分析中常用的分析方法，也是重要的質(zhì)控手段，回收率是判定分析結(jié)果準確度的量化指標。本實驗在東湖陳醋中加標，按照樣品的處理步驟進行分析，得到的結(jié)果減去本底值后與理論值的比值為回收率。本實驗精密稱取2.0mL東湖陳醋共3份，置于50mL離心管中，分成3組，每組3份，加入高、低、中3種不同梯度濃度的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標準溶液0.1mg、1.0mg、2.0mg，按照上述樣品處理方法處理，上機測定，根據(jù)公式計算得出平均回收率。

三、結(jié)果與分析

1.標準曲線、線性范圍。如圖1所示，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉在色譜中均有良好的響應，并能有效分離，效果良好。該方法的濃度范圍為0-200μg/mL，線性方程和相關系數(shù)詳見表1，相關系數(shù)均為0.9999，呈現(xiàn)良好線性。

2.檢出限和定量限。從本方法檢出限的驗證結(jié)果（表2）和定量限的驗證結(jié)果（表3）可以看出，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的偏差均在20%以內(nèi)，說明該方法可行，檢出限和定量限均符合要求。

3.樣品檢驗結(jié)果。按照上述的實驗方法對樣品進行前處理，利用高效液相色譜儀進行檢測，結(jié)果詳見表4。從表 4可以看出，檢測結(jié)果偏差均在0%-3.0%之間，符合標準規(guī)定的小于10%。

4.精密度實驗。將濃度為0.005g/kg、0.01g/kg、1.25g/kg的標準品溶液重復進樣7次，計算測定值的變異系數(shù)，結(jié)果詳見表5。從表5可以看出，變異系數(shù)均小于7%，具有良好的精密度。精密度越小，重復性越高，實驗數(shù)據(jù)越可靠。

5.加標回收實驗。在樣品中加入低、中、高3個水平標準溶液，從表6可知，回收率的范圍為96.2%-106.2%，回收率較高，均在標準規(guī)定的80%-120%之間，說明該方法對食品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的測定能起到很好的質(zhì)量控制目的。

本研究建立了國標高效液相色譜法測定食品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的驗證方法。樣品采用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白，經(jīng)過0.22um濾膜過濾，再經(jīng)C18色譜柱分離，采用蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light-scattering detector，ELSD）檢測。該方法在0-200μg/mL范圍內(nèi)以苯甲酸、山梨酸、糖精鈉濃度的對數(shù)和對應峰面積做標準曲線，相關性良好（r2=0.9996）；平均加標回收率為99.6%-105.3%，方法檢出限和定量限均符合國標方法要求。因此，該方法準確、靈敏，能夠有效、快速地測定食品中的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉。

作者簡介：郝果，碩士，工程師；主要研究方向：食品安全分析檢測。