具有癌癥診療潛力的多功能核殼納米粒

宋 雪，吳靜悅，張 娟，吉嚴蓉，景杰翔，柯亨特

(蘇州大學 藥學院，江蘇 蘇州 215123)

癌癥已成為當今社會人類生命健康的重大威脅之一。臨床上廣泛使用的癌癥治療方式主要包括外科手術治療、放射治療和化學治療等。這些治療方法雖然成功地減少了癌癥死亡率，但仍面臨著缺乏特異性、療效有限、毒副作用較大等諸多問題[1]。光熱治療(Photothermal Therapy，PTT)是近年飛速發(fā)展的一種微創(chuàng)腫瘤治療技術，它利用光吸收材料在光照下將光能轉化為熱能，產生局部高熱量，從而直接導致癌細胞因受熱而損傷、凋亡和消融[2-3]。多種具有杰出的近紅外吸收能力的材料已被開發(fā)研究并用于光熱治療，包括Au納米材料、CuS納米粒、鈀納米片、碳納米材料等[4-8]。CuS納米粒子作為一種新型的無機半導體光吸收劑，它在近紅外區(qū)域有強烈的吸收，最大吸收峰在900～1 000 nm，而且吸收峰不會隨著粒子大小和形狀的改變而發(fā)生改變，具有良好的光熱穩(wěn)定性，且制備方法簡單、成本低[6, 9-11]。

為了實現(xiàn)最佳療效，光熱治療前還需完成腫瘤的定位、腫瘤大小的確定，還需確保光吸收材料在病灶部位足夠的富集濃度，并對治療過程實行監(jiān)測。因此，光熱治療需要通過其他影像方法的指引和輔助來確保治療過程能順利進行，并期望能及時獲取反饋信息，以便采取下一步治療方案。這種將診斷和治療結合為一體的腫瘤治療方法稱為診療一體化(Theranostics)[12-14]。磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)是利用生物體內的不同組織或器官在強磁場的作用下產生磁共振信號，經過圖象重建而成像的一種技術[15]，能為腫瘤治療提供有價值的解剖學信息和體內分布信息，可有效指導和監(jiān)測腫瘤的光熱治療過程[16-17]。MRI是分子成像手段中一個最有力的和非侵入性的診斷技術，基于質子與組織周圍分子的相互作用，能為腫瘤治療提供有價值的解剖學信息和體內生物分布信息[18-19]。Mn3O4是一種具有良好順磁性的造影劑，價格低廉且制備成本低[20-23]?？蓪⑵渲瞥沙叽绾线m的納米粒，并在表面修飾功能基團，使之成為具有診斷、成像、治療等多種功能的復合納米粒。這不僅可以增強其對癌細胞的靶向能力，還能降低Mn離子作為金屬元素而產生的細胞毒性。因此本研究采用具有良好生物相容性的聚合物納米藥物載體，共包載Mn3O4順磁性MRI造影劑和具有較強近紅外光吸收能力的CuS納米粒，構建集磁共振成像與光熱治療為一體的多功能核殼納米粒，實現(xiàn)腫瘤的診療一體化。

1 材料與方法

1.1 材料與實驗儀器

所使用材料如下：聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)(濟南岱罡生物科技有限公司，特性粘度：0.54 dL/g，LA∶GA=50∶50，分子量：63 kDa)；油胺(上海晶純生化科技股份有限公司)；乙酰丙酮錳(C15H21MnO6)(北京百靈威科技有限公司)；一水乙酸銅(Cu(CH3COO)2·H2O)、Na2S·9H2O、NaOH(上海國藥集團)；牛血清白蛋白BSA(沃凱生物醫(yī)藥公司)。 所使用實驗儀器如下：真空干燥機(Martinchrist)；超聲波細胞粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司， JY92-II)；紫外-可見-近紅外分光光度計(日本島津精密儀器公司，UV-2600)；激光粒度儀(美國馬爾文， Nano-ZS90)近紅外激光器(785 nm、980 nm，長春飛秒科技有限公司)；透射電鏡(美國FEI公司，Tecnai G220)。

1.2 方法

1.2.1 油胺穩(wěn)定的Mn3O4納米粒的制備

采用高溫熱解法制備[24]：①精密稱取11.97 g油胺，0.45 g乙酰丙酮錳C15H21MnO6，超聲分散混合均勻后共置于干燥潔凈的100 mL三頸瓶中，放入干燥潔凈的磁力攪拌子，連接冷凝管，通入氮氣，直至反應儀器中原有的空氣完全排除；②在氮氣保護下，用加熱套加熱至162 ℃，磁力攪拌反應11 h，冷卻至室溫后，12 000 r/min高速離心15 min得到棕色沉淀；③取沉淀物，用4～5 mL乙醇超聲與渦旋分散后，3 500 r/min離心洗滌3次，得到Mn3O4納米粒，分散于6 mL的正己烷中。

1.2.2 CuS白蛋白納米粒的制備

采用白蛋白模板法制備[9,25]：①溶液配制：20.0 mM的乙酸銅(Cu(CH3COO)2)溶液；35.0 mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶液；100.0 mM Na2S溶液；2.0 M氫氧化鈉溶液。②取BSA溶液20.0 mL置于50 mL的離心管中，加入4.0 mL Cu(CH3COO)2溶液，在磁力攪拌器上劇烈攪拌1 min，溶液混合均勻后，邊攪拌邊加入2.0 M的NaOH溶液，將反應體系的pH調至12；③劇烈攪拌5 min后，加入配好的Na2S溶液3.5 mL，反應體系變?yōu)辄S褐色；④將反應液轉移到55 ℃水浴鍋中攪拌反應4 h。得到CuS白蛋白納米粒，用去離子水持續(xù)透析24 h，制成CuS白蛋白納米粒的水分散液待用。

1.2.3 核殼納米粒的制備

①取80.0 μL上述制備的含Mn3O4納米粒的正己烷分散液置于通風櫥，完全揮發(fā)正己烷(CH3(CH2)4CH3)；②用分析天平稱取5.0 mg的PLGA溶解于0.2 mL的二氯甲烷(CH2Cl2)中，得到25.0 mg/mL的PLGA/CH2Cl2溶液，并以此溶解Mn3O4納米粒；③將此混合液加入到4.0 mL的含CuS白蛋白納米粒的水分散液中，用超聲波細胞粉碎儀對混合液進行探針超聲乳化(功率400 W，超聲時間2 s，間隔時間2 s，90次)；④將此乳濁液轉移到小玻璃瓶內，放入干燥潔凈的磁力攪拌子，置于通風櫥中，在磁力攪拌器上持續(xù)攪拌揮發(fā)6 h，直至CH2Cl2完全揮發(fā)；⑤對制備的水分散液進行離心洗滌，即得到核殼納米粒(Mn3O4/PLGA@CuS)。

PLGA是經美國FDA認證的藥用輔料，它是一種無毒且可以被人體降解的功能性有機高分子化合物，具有良好的生物相容性，因此可以被廣泛應用于納米材料、藥物載體、生物醫(yī)學等領域和制藥行業(yè)。本研究采用PLGA作為載體，通過超聲乳化-溶劑揮發(fā)法，共包載油溶性的Mn3O4納米粒以及水溶性的CuS白蛋白納米粒，其制備過程如圖1。

圖1 核殼納米粒的制備示意圖

1.2.4 核殼納米粒的理化性質表征

通過透射電鏡、粒徑分布儀、紫外-可見-近紅外分光光度計對于核殼納米粒的形態(tài)、粒徑、吸收光譜進行表征；采用醫(yī)用磁共振成像儀對制備的核殼納米粒進行MRI造影能力的表征，通過醫(yī)用磁共振成像儀測定其縱向弛豫時間T1加權的磁共振增強圖像，并計算其縱向弛豫率r1；采用785、980 nm激光器測定不同濃度核殼納米粒的光熱誘導升溫曲線。

2 結果與討論

2.1 核殼納米粒的理化性質

透射電鏡結果可見，通過高溫熱解法制備的Mn3O4納米粒大多呈現(xiàn)出球形或接近球形的結構，平均粒徑大約為(10 ± 2.1) nm，粒徑均一且分散性較好(圖2(a))。從圖2(b)可以看到，通過蛋白模板法制備的CuS白蛋白納米粒呈現(xiàn)球形或類球形的結構，且經統(tǒng)計計算其粒徑大約為(12 ± 0.9) nm，粒徑較為均一。采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備得到的核殼納米粒在電鏡圖中可觀察到球形或類球形的核殼結構，粒徑在100～200 nm，證明核殼納米粒的成功制備(圖2(c))。

圖2 透射電鏡表征

動態(tài)光散射結果顯示，核殼納米粒的粒徑呈正態(tài)分布，平均粒徑為160 nm，多分散系數(shù)PDI為0.272(圖3)。較小且分布較為均一的尺寸可使納米粒更易于通過EPR效應滲透到達腫瘤組織，實現(xiàn)較高的局部濃度，有助于腫瘤高效診斷和治療。核殼納米粒的線掃描元素分析結果顯示，核殼納米粒含Cu、Mn兩種元素，且Cu在外側含量較高，Mn在內部含量較高(圖4)。該結果證明我們成功制備出以CuS納米粒為外殼，內核為聚合物與氧化錳納米粒的核殼納米粒(Mn3O4/PLGA@CuS)。

圖3 核殼納米粒的粒徑分布

圖4 核殼納米粒的線掃描元素分析結果

Mn3O4納米粒、CuS白蛋白納米粒和制備得到的核殼納米粒的吸收光譜如圖5所示。Mn3O4納米粒在400～1 200 nm的范圍內無明顯的特征吸收峰，而CuS白蛋白納米粒在近紅外區(qū)的700～1 200 nm范圍內出現(xiàn)較為明顯的吸收峰，可通過近紅外光照射實現(xiàn)較強的光熱效應。核殼納米粒在400～1 200 nm的范圍內均有較強吸收且呈遞減趨勢，同時在近紅外區(qū)(700～1 200 nm)出現(xiàn)類似CuS納米粒的較強的吸收，提示其對近紅外光有明顯的吸收作用，具有較強的光熱效應。

圖5 Mn3O4納米粒、CuS白蛋白納米粒和核殼納米粒的吸收光譜

2.2 體外磁共振成像

圖6(a)是不同Mn濃度的核殼納米粒水分散液在磁共振成像儀中得到的T1加權的MRI造影成像圖,可以看出，隨著納米粒水分散液中Mn濃度的升高(從左到右)，其對應的信號值逐漸增強(亮度變亮)，表明該納米粒的磁共振造影性能具有Mn濃度依賴性。縱向弛豫時間的倒數(shù)(1/T1)與濃度間的關系作圖，采用線性擬合得到該核殼納米粒的r1值為1.351 mM-1·s-1，表明其具備良好的磁共振造影能力(圖6(b))。

圖6 核殼納米粒的體外磁共振成像圖及r1值

2.3 光熱效應評價

本研究采用蛋白模板法進行CuS白蛋白納米粒的制備。白蛋白上具有多個金屬結合位點，可通過氨基末端或者半胱氨酸殘基有效結合金屬離子，形成白蛋白-金屬離子復合物[26]。結合的金屬離子可通過還原反應或沉淀反應成核結晶，通過調節(jié)反應條件，控制納米結晶在白蛋白空腔中的生長，形成內部為無機納米材料、表面為白蛋白的核殼型納米粒[3, 9, 16, 25 27-29]。該方法具有生物相容性好、粒徑可控、工藝簡單等特點，可通過生物礦化作用實現(xiàn)無機納米粒的可控合成，具有良好的生物應用前景。

我們分別考察了CuS白蛋白納米粒和核殼納米粒在785 nm和980 nm激光照射下的光熱升溫效應(圖7、圖8)。

如圖7(a)、(b)可見，在785 nm激光照射下，去離子水幾乎不升溫，而不同Cu濃度(0.05、0.10、0.20和0.50 mM)的核殼納米粒在5 min時分別升高了7.9、13.0、20.1和36.0 ℃，隨著濃度的增大升溫效果增強，顯示其濃度依賴的光熱升溫效果，并且濃度相同情況下，核殼納米粒比CuS納米粒的光熱升溫效應更為顯著。而在980 nm激光照射下，核殼納米粒與CuS相比并未表現(xiàn)出明顯提升，但仍可說明核殼納米粒不會影響所負載的CuS納米粒的光熱效果(圖8(a)、(b))。雖然核殼納米粒溫度提升最高可達到50.9 ℃，但由于水在980 nm處具有較強吸收，可在該波長激光照射下升溫約28 ℃。因此，785 nm波長的激光由于較好的避開了水的吸收， 具有較好的選擇性和低毒副作用， 將更有潛力應用于腫瘤光熱治療。

圖7 785 nm激光照射下納米粒的光熱升溫效應

圖8 980 nm激光照射下納米粒的光熱升溫效應

3 結 論

癌癥已成為現(xiàn)今社會嚴重威脅人類生命健康的疾病之一，并且發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，研究并構建診斷治療一體化納米藥物，對實現(xiàn)腫瘤高效診治具有重要意義。

本文通過高溫熱解法制備Mn3O4納米粒，同時采用蛋白模板法制備CuS白蛋白納米粒，最后以可降解性高分子PLGA作為載體，通過超聲乳化的方法，制成共包裹Mn3O4和CuS納米粒的核殼納米粒。該納米粒具有如下特征：

1)核殼納米粒具有球形或類球形結構，平均粒徑為160 nm，分散較為均一且穩(wěn)定性較好，在近紅外區(qū)有較強吸收；

2)體外磁共振成像研究表明該核殼納米粒保留了Mn3O4納米粒的MRI造影劑功能；

3)同時，體外光熱效應研究表明該納米粒具有較強的光熱治療能力，可用于腫瘤的診療一體化，在磁共振造影成像的引導下，實現(xiàn)腫瘤的光熱消融治療。