溶藻弧菌PEPCK蛋白原核表達(dá)及其乙酰化、琥珀?；揎椀蔫b定

曾福源 蘇澤輝 周詩(shī)慧 謝妙 龐歡瑛

（1.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，深圳 510000；2.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088）

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）作為糖異生過程中的一個(gè)關(guān)鍵代謝酶，催化草酰乙酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐际奖岷投趸?，是幾乎所有生物體糖異生中所必須的［1-2］。根據(jù)草酰乙酸無(wú)機(jī)磷酸鹽供體的來(lái)源，PEPCK可分成ATP依賴性、GTP依賴性和PPi（inorganic pyrophosphate，PPi）依賴性 3 種類型［3-5］。該酶參與的代謝過程，在生物體血糖水平［6］、毒力調(diào)控［7］、抗病毒［8］。等方面均具有十分重要的作用，在不同生物的碳代謝中也具有不同的生理作用［9］。此外，還能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，是一種很好的疫苗候選分子［10-11］。

蛋白質(zhì)乙酰化是一種常見的翻譯后修飾方式，參與轉(zhuǎn)錄、新陳代謝、趨化作用、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)生物學(xué)過程，并發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用［12］。乙?；ㄟ^多種機(jī)制調(diào)節(jié)代謝酶活力，對(duì)代謝具有廣泛的調(diào)控功能［13］。乙酰化修飾代謝酶可對(duì)糖酵解和糖異生代謝方向進(jìn)行調(diào)控，如增加GapA（磷酸脫氫酶）的乙酰化程度可以增強(qiáng)菌體糖酵解活性，同時(shí)降低葡萄糖新生的能力［14］。在鼠傷寒沙門菌中，蛋白質(zhì)乙?；揎梾⑴c了細(xì)菌毒力的調(diào)控及其體外誘導(dǎo)株耐藥性的產(chǎn)生［15-16］。

蛋白質(zhì)賴氨酸琥珀?；晴牾；w通過酶學(xué)或非酶學(xué)的方式將琥珀酰基團(tuán)共價(jià)結(jié)合到賴氨酸殘基的過程［17］，是近年來(lái)頗受關(guān)注的一種翻譯后修飾。琥珀酰化和乙?；ǔ＞哂休^多的重疊位點(diǎn)，與乙?；揎椣啾?，琥珀酰化修飾更能促進(jìn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化［18］。琥珀?；揎棌V泛存在于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中［19-20］，參與糖酵解、三羧酸循環(huán)、電子傳遞鏈等多種細(xì)胞代謝過程中關(guān)鍵酶活性的調(diào)控［21］。在結(jié)核分枝桿菌琥珀?；揎椊M學(xué)圖譜中，許多代謝酶及抗生素耐藥相關(guān)蛋白發(fā)生了琥珀?；揎棧?2］。

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是隸屬于弧菌科弧菌屬的嗜鹽嗜溫性革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于海洋、河口、海水養(yǎng)殖池等水體環(huán)境中［23］，是魚、蝦、貝類的主要病原菌，給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［24-26］。免疫蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)PEPCK蛋白具有免疫原性，為溶藻弧菌、哈維氏弧菌及副溶血性弧菌的交叉免疫原蛋白，是亞單位疫苗的候選抗原［27］。此外，PEPCK與溶藻弧菌的耐藥性密切相關(guān)［28］。最近報(bào)道的弧菌乙?；?、琥珀?；揎椊M學(xué)圖譜中也發(fā)現(xiàn)了PEPCK，但其修飾特性尚未得到驗(yàn)證［29-30］。本研究通過構(gòu)建溶藻弧菌PEPCK蛋白的原核表達(dá)載體，優(yōu)化其表達(dá)條件，并對(duì)其乙?；扮牾；揎椷M(jìn)行鑒定，旨為進(jìn)一步探究PEPCK的乙酰化和琥珀?；揎棇?duì)溶藻弧菌的毒力及耐藥性的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

溶藻弧菌HY9901、大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）和表達(dá)載體pET-28a均由本實(shí)驗(yàn)室保存。T4 DNA連接酶、EcoR I和Xho I限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；細(xì)菌基因組抽提試劑盒、核酸切膠回收試劑盒購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；異丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；鼠抗乙酰化賴氨酸抗體（antiacetyllysine mouse mAb（clone Kac-01），#PTM-101）、鼠抗琥珀酰化賴氨酸抗體（anti-succinyllysine mouse mAb（clone 3D3），PTM-419）購(gòu)自杭州景杰生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG（H+L，#A0216）和His標(biāo)簽蛋白純化介質(zhì)BeyoGold His-tag Purification Resin（耐變性劑型）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL顯色液（ClarityTMWestern ECL Substrate）購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 pepck基因的克隆 將HY9901菌株加入100 mL TSB培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600nm達(dá)0.8時(shí)，使用細(xì)菌基因提取試劑盒，按說明書提溶藻弧菌HY9901的DNA。根據(jù)GenBank上溶藻弧菌pepck基因序列（No：MT683849）設(shè)計(jì)分別含EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)的正反鏈引物，正鏈引物F：CCGGAATTCATGACCGTTATGGAACAT（下劃線為EcoRI酶切位點(diǎn)），反鏈引物R：CCGCTCGAGATCAATCTGAGGACCAGC（下劃線為XhoI酶切位點(diǎn)）。以溶藻弧菌HY9901的DNA為模板鏈擴(kuò)增pepck基因，PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 5 min；95℃變性 30 s，62℃退火 30 s，72℃延伸 1.5 min，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，按照DNA凝膠回收試劑盒的說明進(jìn)行純化。

1.2.2 pET-28a-pepck表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明提取pET-28a質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI和XhoI酶切，用T4DNA連接酶將切膠回收的產(chǎn)物與酶切后的pET-28a置于4℃冰箱中連接過夜。連接成功后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)無(wú)抗性的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h后涂布于LB平板（含Kana 100 μg/mL），挑取單菌落，接種于 800 μL LB（含 Kana 100 μg/mL）培養(yǎng)基中，于37℃條件下振蕩培養(yǎng)過夜，進(jìn)行菌液PCR鑒定。鑒定引物序列為F：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG，R：TAATACGACTCACTATAGGG。挑取陽(yáng)性菌液送至生工測(cè)序。

1.2.3 PEPCK蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 按體積比1∶100的比例，將含pET-28a-pepck重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）接種于 LB（含 Kana 100 μg/mL）培養(yǎng)液中，于37℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，于37℃條件下200 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12 h。取1 mL培養(yǎng)物，12 000×g室溫離心2 min，棄上清，用1 mL PBS洗滌兩遍。加入 50 μL PBS和 10 μL 6× 蛋白上樣緩沖液重懸菌體，水煮法提取細(xì)菌蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析。對(duì)照組為IPTG的pET-28a、不含IPTG的pET-28a、pET-28a-pepck，處理方法與實(shí)驗(yàn)組一致。

1.2.4 PEPCK蛋白表達(dá)條件優(yōu)化 采用控制變量法，對(duì)不同溫度、IPTG濃度和時(shí)間條件下重組菌株的PEPCK蛋白表達(dá)效果進(jìn)行比較。當(dāng)OD600nm達(dá)0.4-0.6時(shí)開始誘導(dǎo)。

溫度：設(shè)置28℃和37℃兩個(gè)溫度，在IPTG濃度為0.2 mmol/L條件下振蕩培養(yǎng)10 h，收集10 mL菌液，4℃ 6 000 r/min離心30 min，棄上清，用6 mL的PBS吹勻、洗滌兩遍后懸浮菌體。置于冰水混合物中超聲波破碎重組細(xì)菌，破碎程序設(shè)置為：功率300 W，超聲開時(shí)間5 s，超聲關(guān)時(shí)間8 s，超聲破碎10 min至菌液清澈透亮即可。離心、分裝上清和沉淀，沉淀用8 mol/L尿素在4℃條件下浸泡過夜，各取50 μL并分別加入10 μL 6× 蛋白質(zhì)上樣緩沖液，充分混勻后以10 μL/孔的上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色、脫色液（40%乙醇，10%冰醋酸，50%雙蒸水）脫色，最后使用Gel-pro Analyzer分析結(jié)果。

IPTG濃度：在28℃，誘導(dǎo)時(shí)間為10 h的條件下，IPTG濃度設(shè)置為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L。菌液收集、處理及分析如1.2.3的步驟。

時(shí)間：在28℃，IPTG濃度為0.2 mmol/L的條件下，誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)置為0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、和10 h。菌液收集、處理及分析如1.2.3的步驟。

1.2.5 His-PEPCK蛋白的純化 經(jīng)最優(yōu)誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)后，收集菌液、提取蛋白，采用His標(biāo)簽蛋白純化介質(zhì)過柱純化。將蛋白與填料在4℃條件下孵育過夜，隨后加入純化柱中，按碧云天公司的His標(biāo)簽蛋白純化介質(zhì)使用說明書操作。

1.2.6 Western blot驗(yàn)證PEPCK蛋白的乙?；扮牾；?取純化后的PEPCK蛋白，加入Loadind Buffer混勻，取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE，電泳條件：5%濃縮膠，80 V 30 min；10%分離膠，120 V 90 min。使用轉(zhuǎn)印儀將PEPCK蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，條件為：200 mA，90 min。加入含5%脫脂奶粉的TBST溶液，置于4℃冰箱封閉過夜，TBST漂洗4次，每次10 min。分別加入2 μL景杰生物科技有限公司的鼠抗乙?；嚢彼峥贵w和鼠抗琥珀酰化賴氨酸抗體（1∶5 000），37℃孵育2 h，TBST漂洗4次，每次10 min。加入1 μL碧云天生物技術(shù)有限公司的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶10 000），37℃孵育2 h，TBST漂洗4次，每次10 min。經(jīng)ECL顯色液顯色后，使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（TAN 5200）拍照、記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 pepck基因的克隆

挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增得到目的片段，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)條帶大小約1 629 bp（圖1），與pepck ORF大小一致，表明pepck基因克隆成功。

2.2 重組質(zhì)粒pET-28a-pepck的構(gòu)建

pepck基因片段與pET-28a質(zhì)粒成功重組后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果獲得1 989 bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。經(jīng)測(cè)序未發(fā)現(xiàn)pepck有錯(cuò)配或突變，證明原核表達(dá)載體pET-28a-pepck構(gòu)建成功。

圖1 pepck基因的克隆Fig.1 Cloning of pepck gene

圖2 構(gòu)建pET-28a-pepck載體Fig.2 Construction of pET-28a-pepck vector

2.3 誘導(dǎo)PEPCK蛋白表達(dá)

成功構(gòu)建的重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量約60.9 kD的PEPCK融合蛋白（圖3），其中PEPCK的預(yù)計(jì)分子量60.1 kD，pET-28a表達(dá)的融合標(biāo)簽為0.8 kD。對(duì)照組均未表達(dá)PEPCK蛋白。

2.4 PEPCK蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

2.4.1 溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響 當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28℃時(shí)，PEPCK的融合蛋白、可溶性蛋白及包涵體蛋白均有表達(dá)（圖4）；當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37℃時(shí)，PEPCK融合蛋白、包涵體蛋白表達(dá)量較28℃時(shí)高，但在可溶性蛋白中幾乎為零。

2.4.2 IPTG濃度對(duì)重組蛋白的影響 結(jié)果顯示，PEPCK蛋白在濃度為0.2 mmol/L-1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)量無(wú)顯著差異，表明IPTG濃度變化對(duì)PEPCK表達(dá)量無(wú)明顯影響（圖5）。

圖3 PEPCK蛋白SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of PEPCK protein

圖4 溫度對(duì)PEPCK蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Influence of temperature on the expression of PEPCK protein

2.4.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白的影響 PEPCK蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間增長(zhǎng)呈現(xiàn)出先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)，在8 h表達(dá)量達(dá)到最大（圖6）。綜上，PEPCK蛋白最佳表達(dá)條件為28℃、0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)8 h。

2.5 His-PEPCK蛋白的純化

融合蛋白經(jīng)his親和層析柱純化后，經(jīng)SDSPAGE進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，在洗脫液濃度為250 mmol/L時(shí)可獲得大量純化蛋白（圖7）。

2.6 PEPCK蛋白的乙酰化及琥珀?；揎椀蔫b定

分別使用抗乙酰賴氨酸抗體和抗琥珀酰賴氨酸抗體進(jìn)行Western-blot分析，鑒定PEPCK的乙?；㈢牾；揎?。結(jié)果顯示，PEPCK蛋白具有乙?；▓D8-A）和琥珀?；揎棧▓D8-B）。

圖5 IPTG濃度對(duì)PEPCK蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Influence of IPTG concentration on the expression of PEPCK protein

圖6 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)PEPCK蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Influence of induction time on the expression of PEPCK protein

3 討論

圖7 PEPCK蛋白的純化Fig.7 Purification of PEPCK protein

圖8 PEPCK蛋白的乙?；ˋ）及琥珀?；˙）鑒定Fig.8 Acetylation and succinylation identification of PEPCK protein

隨著基因表達(dá)技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，人們不僅關(guān)注蛋白的表達(dá)量，更注重正確的翻譯后折疊、修飾，使表達(dá)蛋白的活性和穩(wěn)定性更高［31］。溫度是大腸桿菌生長(zhǎng)代謝的重要影響因子，低溫條件下蛋白質(zhì)的合成速率降低，疏水作用降低，多肽折疊的動(dòng)力學(xué)改變可以增加正確折疊的蛋白含量［32］，并及時(shí)將產(chǎn)生的前蛋白運(yùn)輸?shù)街苜|(zhì)腔或培養(yǎng)基，降低了形成包涵體、阻礙蛋白分泌的幾率［33］。在37℃時(shí)大腸桿菌生長(zhǎng)最快，細(xì)胞膜流動(dòng)性和蛋白合成速率增加，但胞內(nèi)前蛋白堆積過多會(huì)導(dǎo)致包涵體的形成增加［34］。本研究設(shè)置28和37℃兩個(gè)溫度，相比之下誘導(dǎo)溫度為28℃時(shí)PEPCK蛋白表達(dá)效果更佳。采用不同IPTG濃度進(jìn)行誘導(dǎo)，在0.2 mmol/L-1.0 mmol/L范圍內(nèi)蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化，這與彭傳林等［35］發(fā)現(xiàn)IPTG濃度對(duì)家蠅抗真菌肽（MAF-1）目的蛋白的表達(dá)無(wú)顯著影響相符，因此實(shí)驗(yàn)過程中使用0.2 mmol/L的IPTG即可。溶藻弧菌PEPCK蛋白的表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的增長(zhǎng)，呈先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)，誘導(dǎo)8 h時(shí)達(dá)到峰值，而陳立明等［36］發(fā)現(xiàn)DTD蛋白誘導(dǎo)5 h表達(dá)量最高，可能是因?yàn)椴煌鞍字g存在差異，導(dǎo)致所需的誘導(dǎo)時(shí)間不一致。

蛋白質(zhì)組學(xué)的突起，尤其是質(zhì)譜儀靈敏度、速遞和自動(dòng)化的大幅提升，使蛋白質(zhì)翻譯后修飾大規(guī)模化研究成為可能［37］。賴氨酸乙酰化是一種普遍存在的蛋白調(diào)控方式，能對(duì)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，特別是對(duì)代謝酶進(jìn)行精確調(diào)控［38-39］。細(xì)胞中這種精確調(diào)控的實(shí)現(xiàn)，得益于賴氨酸乙?；负腿ヒ阴；傅南嗷プ饔茫?0］。在霍亂弧菌中，醋酸的代謝受去乙酰化酶的調(diào)節(jié)，該酶的缺失會(huì)導(dǎo)致其對(duì)黑腹果蠅的毒力降低［41］。此外，乙?；揎椶D(zhuǎn)錄因子如CRP、PhoB可直接參與霍亂弧菌毒力的調(diào)節(jié)［42］。隨著各種翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多的研究表明賴氨酸乙?；揎椗c琥珀?；揎椌哂懈叨戎睾系默F(xiàn)象，共同影響代謝途徑中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能［43］。已知PEPCK與副溶血弧菌的耐藥性及毒力相關(guān)，且具有乙酰化和琥珀?；揎棧?0，44］。PEPCK作為溶藻弧菌糖代謝中的關(guān)鍵酶，在輔助因子乙酰輔酶A的作用下，乙酰轉(zhuǎn)移酶催化其賴氨酸殘基發(fā)生乙酰化修飾［45］。而發(fā)生在賴氨酸殘基上的琥珀酰化可促進(jìn)更多蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，在生理pH下電荷從+1到-1，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)整［46］。大腸桿菌也含有賴氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶和琥珀酰基供體，利用大腸桿菌重組表達(dá)PEPCK蛋白時(shí)可在其賴氨酸殘基上進(jìn)行乙酰化和琥珀?；揎棧?7］。此外，通過比較大腸桿菌中已發(fā)現(xiàn)的乙?；稽c(diǎn)及琥珀?；稽c(diǎn)，有66%是重疊的，表明兩種修飾可以發(fā)生在同一位點(diǎn)上［48］，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果中PEPCK蛋白同時(shí)具有乙?；揎椇顽牾；揎検呛侠淼?。

總的來(lái)說，本研究使用鼠抗乙酰化賴氨酸抗體、鼠抗琥珀?；嚢彼峥贵w作為一抗，驗(yàn)證了溶藻弧菌PEPCK既有乙?；揎?，又有琥珀?；揎?，為進(jìn)一步探究PEPCK的乙?；顽牾；揎棇?duì)溶藻弧菌的毒力及耐藥性的影響奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建溶藻弧菌PEPCK重組表達(dá)菌株，其最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件為0.2 mmol/L IPTG，28℃誘導(dǎo)8 h；經(jīng)鑒定PEPCK蛋白具有乙?；揎椇顽牾；揎?。