木質素過氧化物酶的應用

梁曉玉，崔周磊，王洪成，陳華友

(江蘇大學 生命科學研究院，鎮(zhèn)江 212013)

木質素過氧化物酶(Lignin peroxidases，LiP)、錳過氧化物酶(Manganese peroxidase，MnP)、漆酶(Laccase，Lac)等構成了白腐菌的主要木質素降解酶系，與木質素降解輔助酶系協(xié)同降解木質素。LiP主要來源于真菌，是血紅素過氧化物酶超家族Ⅱ類過氧化物酶中的一員。在木質素降解酶系中，LiP氧化還原電位比MnP、Lac高，除降解木質素外，還能降解生態(tài)系統(tǒng)中其他難降解的高分子化合物，這提高了LiP的應用價值。LiP在化學化工、生態(tài)修復、生物飼料等行業(yè)具有廣闊的應用前景，是當前研究的熱點，本文綜述了近年來LiP的研究進展，并對其研究前景進行展望。

1 LiP的催化機制

LiP有一個所謂的配體通道，可使小分子底物通過通道與血紅素直接作用。底物的大小和理化性質共同決定其能否通過配體通道與血紅素反應。Ecker等[1]研究發(fā)現(xiàn)，除草劑阿特拉津進入配體通道后與通道中某些氨基酸殘基結合，最終無法到達血紅素腔活性位點。這類物質與配體通道結合后能否再被釋放出來，其與配體通道結合時是否會阻礙其他底物對血紅素腔的可及性，以及是否會對LiP的其他活性位點產(chǎn)生影響，值得深入探究。目前對配體通道中氨基酸殘基了解有限，明確配體通道中關鍵氨基酸殘基、分析配體通道的功能是下一步研究的方向，這有利于深入了解LiP作用機理，并對LiP改性提供參考。

木質素等大分子物質無法通過通道與血紅素作用，而是通過酶表面氨基酸殘基經(jīng)長電子轉移機制最終與血紅素反應。Sandra等[2]提出長電子轉移機制兩種可能的電子轉移路徑，一種是Phe’s 路徑，按照Trp171-Phe205-Trp251的順序轉移自由基，另一種被稱為Phe#2’s 路徑，按照Trp171-Asp264-Phe265-Phe267 的順序轉移自由基，這兩種轉移路徑與多功能過氧化物酶中發(fā)現(xiàn)的電子轉移路徑類似。雖然對LiP這兩個氧化位點有了初步了解，但它們之間的聯(lián)系尚不清楚。

藜蘆醇(Veratryl alcohol，VA)既可作為LiP催化底物，也可充當LiP催化反應的介質，提升酶促效率。有研究認為LiP氧化VA生成的芳基陽離子自由基VA+·可以擴散到周圍體系中，拓展LiP作用范圍。這種假說被Houtman等[3]否定，他們以黃孢原毛平革菌(PhanerochaetechrysosporiumBurdsall)LiP(H8)為研究對象，認為真菌LiP不使用VA+·作為擴散的木質素降解氧化劑，但實驗中并未涉及其他LiP同工酶，對是否存在LiP以VA+·為擴散氧化劑還需進一步研究。

2 LiP酶活測定

基于毛細管電泳的膠束電動色譜法可應用于未純化、未濃縮的微量LiP酶活測定。膠束電動毛細管色譜法是色譜和電泳分離原理相結合的一種復合方法，首先通過電泳分離目標產(chǎn)物，然后通過色譜進行定量分析[4]。Airi等[5]已成功應用該方法測定LiP活性。研究發(fā)現(xiàn)，某些底物如VA和Mn2+，LiP和MnP均具有氧化能力，但它們對同種底物氧化的能力不同，Sumire等[6]基于此，應用膠束電動毛細管色譜法成功測定了LiP和MnP混合體系中LiP和MnP活性。這種基于酶活差異同時測定混合體系中不同酶酶活的方法理論上適用于兩種或兩種以上酶的混合體系，但使用時體系中酶的種類要與底物種類一致，否則難以計算。

膠束電動色譜法靈敏、準確，且樣品無需濃縮，可直接用于酶活測定，但其對設備要求較高，實驗條件限制了膠束電動色譜法的廣泛推廣。目前LiP酶活測定主要還是通過分光光度計進行，VA、天青B等物質均可作為分光光度法測LiP酶活的底物。藜蘆醇氧化法測LiP酶活的原理是LiP在H2O2存在時催化VA轉化為藜蘆醛，根據(jù)310 nm處吸光度變化值計量LiP酶活[7]。天青B法通過監(jiān)測OD651處吸光度變化計量LiP酶活。酶活測定時，310 nm處吸光度易受粗酶液中芳香化合物及其他過氧化物酶干擾，651 nm處吸光度受此影響較小，但天青B法測定時間較長，因此，當測量體系中干擾較多且時間允許時，可選擇天青B法；當測量體系干擾較少時，藜蘆醇氧化法更加便捷。

對比不同研究發(fā)現(xiàn)，即使選擇同種底物，LiP酶活測定體系中緩沖液、pH值、反應體系也存在差異[8-10]，這使得不同研究中的LiP酶活不具有對比性，因此，亟須制定LiP酶活測定的統(tǒng)一標準。

3 LiP克隆表達

天然產(chǎn)LiP菌株產(chǎn)酶不穩(wěn)定，表達量低，所產(chǎn)LiP其性質多不適用于工業(yè)生產(chǎn)，因此，人們將LiP異源表達以提高LiP的表達量、改善LiP的理化性質，使其更滿足人們的應用需求。LiP主要在大腸桿菌中過表達，獲得純品蛋白后進行酶學鑒定。值得注意的是，木質素降解酶類其酶學性質鑒定多以木質素結構類似物為底物，缺乏真正意義上以秸稈中木質素為底物的性能評估。崔周磊等[11]將來源于白囊耙齒菌(Irpexlacteus)的MnP在大腸桿菌中異源表達，以木質素為底物評估所得MnP效能，所得MnP可使玉米秸稈、麩皮中木質素降解率分別可達35.8%和27.3%，這種酶活鑒定方法使得酶的應用潛力更加直觀。

雖然已有數(shù)個LiP在大腸桿菌中成功過表達，但目的蛋白多以包涵體形式產(chǎn)生，分離純化復性不便，且其生物安全性存在疑問，工業(yè)化尤其是食品工業(yè)級應用困難。出于工業(yè)化應用的目的，LiP克隆表達需要選擇合適的受體菌。LiP在其他表達系統(tǒng)如黑曲霉、桿狀病毒等克隆表達的研究也有報道，但應用價值較低[12-13]；肖建龍等[14]在食品微生物釀酒酵母中成功表達有活性LiP，但實用性未知?？莶菅挎邨U菌作為飼用菌種，一般具有生物安全性，且生長速度快，能夠產(chǎn)生大量胞外蛋白，因此有望作為LiP胞外表達的工業(yè)級宿主。目前已篩選得到可以胞外分泌LiP的枯草芽孢桿菌[8]，為提升LiP胞外表達量，需要進一步優(yōu)化啟動子和信號肽。由于釀酒酵母的ADH7啟動子可以在木質素衍生物香蘭素濃度達到一定限度時啟動目的基因表達降解香蘭素[15]，香蘭素既是誘導物又是底物，這類高效低成本產(chǎn)LiP的啟動子有望應用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)LiP。

工業(yè)化應用時，LiP需要耐受環(huán)境因素的影響，天然LiP穩(wěn)定性不高，耐受能力不強，因此，除通過基因工程提升酶的產(chǎn)量外，還應提升酶的穩(wěn)定性，使其更能耐受環(huán)境影響。Semba 等[16]構建真菌過氧化物酶系統(tǒng)發(fā)育樹，推斷真菌LiP祖先氨基酸序列，并設計多個含有祖先氨基酸殘基的突變酶，所得突變酶熱穩(wěn)定性優(yōu)于野生型；Karla等[9]構建LiP基因的隨機誘變文庫，所得突變LiP能耐受更高濃度的H2O2；Le等[17]在黃孢原毛平革菌LiP(H8)中引入鹽橋，提高了LiP的耐酸性，工程酶在極端酸性條件下的半衰期提高了12.5倍。耐受極端環(huán)境的酶可以拓寬酶的工作范圍，其合成對LiP工業(yè)化應用具有重大意義。

4 LiP與木質素降解

木質素是由松柏醇、芥子醇和對香豆醇3種醇單體聚合而成的高分子化合物，這些醇單體通過碳碳鍵、醚鍵互相偶聯(lián)，然后通過自由基機制聚集形成木質素聚合物[18]，這種聚合物包被著纖維素和半纖維素，且本身結構緊密，限制木質纖維素的利用。

LiP在H2O2存在時可以氧化各種酚類芳香底物、非酚類木質素以及一系列氧化還原電位高于1.4 V的化合物，被認為是木質素降解最高效的酶[19]。LiP催化非酚類木質素降解時，從酚或苯環(huán)上提取一個電子生成自由基，然后通過后續(xù)的非酶反應經(jīng)側鏈裂解、去甲基化、分子內加成和重排等方式破壞木質素分子的主要化學鍵，導致木質素降解[20]。LiP催化木質素中的芳香環(huán)發(fā)生裂解，裂解生成的酚衍生物轉化為醌類化合物后，經(jīng)一系列酶的協(xié)同作用，以纖維二糖酸內酯的形式進入三羧酸循環(huán)或戊糖磷酸途徑，終產(chǎn)物為CO2[21]。LiP降解木質纖維素的效果多用木質纖維素降解率衡量，此外，LiP降解木質纖維素后還原糖、總酚量、酚羥基含量等指標也被用于描述木質素降解程度[22-23]，因木質素降解產(chǎn)物多樣[24]，多指標相互驗證才能更準確地評估LiP降解木質素的效果。

5 LiP的協(xié)同作用與應用前景

5.1 LiP用于化工行業(yè)

LiP可降解黑色素，可替代美白產(chǎn)品中常用的苯二酚[7]。LiP的催化活性依賴于H2O2，但高濃度的H2O2會導致LiP失活，因此，美白產(chǎn)品中需要持續(xù)存在低濃度的H2O2。HO等[25]在美白產(chǎn)品中協(xié)同LiP與葡萄糖氧化酶，利用葡萄糖氧化酶生成的H2O2催化LiP對黑色素脫色，避免了高濃度H2O2使LiP失活，提高了黑色素的脫色效率。此外，LiP降解木質素產(chǎn)生的二元羧酸、小分子酚類物質等是重要化工原料，如：LiP降解木質素產(chǎn)生的香蘭素可代替天然香蘭素用于食品、化妝品行業(yè)；LiP作用于木質纖維素，脫木質素后作為原料生產(chǎn)乙醇等。LiP在化學化工行業(yè)的更多應用潛力尚待挖掘。

5.2 LiP用于生態(tài)修復

生態(tài)系統(tǒng)中的紡織廢水、農(nóng)藥、抗生素等有機化合物嚴重威脅著人類健康，但環(huán)境中這些污染物濃度較低，且種類多樣，LiP雖然具有很強的降解這些污染物的能力，但其產(chǎn)量少，難以大規(guī)模投放；底物譜有限，單獨作用效果不佳[26]。Pylypchuk等[27]將辣根過氧化物酶與LiP固定到納米粒子上，多酶協(xié)同固定化不僅使酶作為催化劑可以重復使用，還提高了污染物的降解效率。pail等[28]將產(chǎn)LiP的細菌和其他細菌同時投放到紡織廢水污染的土地上，發(fā)現(xiàn)混合微生物的染料脫色和解毒作用比單菌株更明顯。多酶或菌酶協(xié)同一定程度上提升了酶的利用效率，然而，這種投放方式針對性不強。根據(jù)底物特征，有規(guī)劃地投放合理的復合酶系能更有效地提升利用率，這需要我們在投放之前能夠明確體系中底物種類及其與酶的作用潛力。Berbar等[29]首次嘗試并建立了一套評估底物對酶敏感性的理化指標，評估了25種有機污染物的氧化還原酶敏感性，敏感性評分與降解率基本一致。類此，建立LiP對底物敏感性的理化指標，評估底物敏感性后，針對性投放合理的酶處理體系可以避免酶無效投放。

5.3 LiP與生物飼料

中國秸稈資源豐富，但沒能得到充分利用，木質素降解菌或者酶處理秸稈后轉化為生物飼料，既能提高秸稈利用率，又解決了牧區(qū)牛羊粗飼料短缺、人畜爭糧爭地的問題。

秸稈中高含量的木質纖維素成分難以被動物消化，且影響飼料適口性。微生物發(fā)酵后的秸稈中木質纖維素被降解成易于吸收的含糖物質，既提高了適口性，又提高了營養(yǎng)價值。實際應用中，單一菌種底物譜有限，酶活普遍較低，不能滿足降解需求，而多菌種混合發(fā)酵可以提供較為完整的木質纖維素酶體系，提高降解效率，降低時間成本，提高微生物對大規(guī)模應用的適用性[30]。粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)含有豐富的纖維素降解基因，表達數(shù)種纖維素降解酶，能夠有效降解纖維素[31]。崔周磊[32]將MnP基因克隆于食品安全級粟酒裂殖酵母中，工程菌協(xié)同粗糙脈孢菌等發(fā)酵菌種制備秸稈生物飼料，與單菌種發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵過程中菌酶協(xié)同作用轉化了菌種之間對碳源的競爭，提高了發(fā)酵的效率和品質。除食品級粟酒裂殖酵母外，木質素降解酶在飼用菌種如枯草芽孢桿菌中克隆表達有助于推進秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物飼料化。

6 總結與展望

LiP具有強大應用潛力，但無法大規(guī)模應用，根本原因是產(chǎn)酶菌生長緩慢、產(chǎn)酶量低，以及酶本身性質限制，因此，LiP的克隆表達應圍繞受體菌、表達量、酶學性質3個方面。對工程菌質量的綜合評估，應以應用目的為基準，如在生物飼料行業(yè)中，LiP的安全性至關重要，LiP的克隆宿主應選擇無抗，生物安全且可用于飼料的菌種，在此基礎上進一步優(yōu)化產(chǎn)酶量及酶學性質；在環(huán)境治理中，普遍認為真菌抗逆性優(yōu)于細菌，因此，受體菌應優(yōu)先選擇真菌，受體菌中酶活力也不是評估工程菌質量的唯一標準，酶的適用性和酶活力共同決定酶的應用價值。此外，如何使LiP高效應用是研究的另一個重點。小分子介質被認為能夠拓寬酶底物范圍，提升酶活力，目前對LiP-介質系統(tǒng)的研究落后于MnP和Lac，且相關研究多為ABTS、HBT、HAA等介質，這類介質價格昂貴，不適合大規(guī)模工業(yè)化應用，理想介質應該高效提升酶活，且不會給環(huán)境帶來污染，同時廉價、易于獲取且高效，因此，還需進一步篩選優(yōu)質LiP介質。酶與酶之間協(xié)同作用已經(jīng)被證實[24]，除木質素降解酶之間的協(xié)同外，構建作用范圍廣且高效的完整酶系可大大提升LiP的應用價值。