決明胰蛋白酶抑制劑的同源建模與定點突變

李超林，張 田，鄒 萌，廖 海，周嘉裕

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031)

Kunitz蛋白酶抑制劑(Kunitz protease inhibitor，KPI)是存在于植物中的一類活性肽，能夠與胰蛋白酶等絲氨酸蛋白酶形成復(fù)合物，競爭性抑制靶酶的活性[1]。KPI在植物抵抗生物及非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，具有抗蟲、抗腫瘤、抗感染、抗病毒和抗真菌等多種生物學(xué)活性。牛蓓等[2]將麻瘋樹Kunitz型蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)入煙草中，通過葉片飼養(yǎng)棉鈴蟲幼蟲實驗證明，轉(zhuǎn)基因植株對棉鈴蟲具有一定的抗蟲性；Fang等[3]從韓國大黑豆中純化出Kunitz型胰蛋白酶抑制劑，能夠抑制HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶的活性，具有抑制HIV-1病毒增殖的潛能。

分析大豆胰蛋白酶抑制劑(Soybean trypsin inhibitor，STI)等KPI家族成員的三維結(jié)構(gòu)晶體，發(fā)現(xiàn)它們具有典型的β-三葉草(β-trefoil)型三維結(jié)構(gòu)。該類結(jié)構(gòu)包含了一個由12個反向平行β-折疊組成的疏水核心，其中6個β-折疊形成底部的β-桶(β-Barrel)，其余6個β-折疊形成疏水核心頂部的蓋子(Lid)。該疏水核心的穩(wěn)定性對于整體結(jié)構(gòu)的維系發(fā)揮關(guān)鍵性作用。根據(jù)序列比對分析，發(fā)現(xiàn)疏水核心中存在較多的芳香族與脂肪族等疏水性氨基酸，推測它們通過疏水作用和氫鍵與鄰近的氨基酸相互聯(lián)系，參與核心結(jié)構(gòu)的形成與穩(wěn)定。由此，確定這些疏水性氨基酸并認(rèn)識其作用能夠有助于認(rèn)識β-三葉草結(jié)構(gòu)形成的分子機制，并對未來的結(jié)構(gòu)改造具有指導(dǎo)作用。

決明(Cassiaobtusifolia)為豆科決明屬植物。實驗室在前期研究中，從決明種子中克隆得到?jīng)Q明胰蛋白酶抑制劑(Cassiaobtusifoliatrypsin inhibitor，CoTI，GenBank登錄號AIU39184.1)基因的全長cDNA序列，并獲得有活性的重組蛋白[4]。分析CoTI氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)CoTI與其他KPI成員均含有1個保守的Trp114殘基，隨后利用同源建模的方法預(yù)測CoTI的三維結(jié)構(gòu)及Trp114殘基在三維結(jié)構(gòu)中可能的作用，最后通過定點突變對推測進行驗證，為CoTI的結(jié)構(gòu)研究及可能的分子改造奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

CoTI-pET28a重組大腸桿菌表達載體由本實驗室構(gòu)建并保存，大腸桿菌Rosseta(DE3)由本實驗室保存；限制性內(nèi)切酶、Prime star DNA聚合酶、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；BAPNA(N-Benzoyl-DL-arginine-p-nitroaniline)購自Sigma公司；質(zhì)粒提取試劑盒Omega Plasmid Mini Kit I、膠回收試劑盒Gel Extraction Kit為OMEGA公司產(chǎn)品；定點突變系統(tǒng)Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2購自南京諾唯贊公司；異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)購自MEKER公司；卡那霉素、氯霉素購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 序列比對及同源建模

從PDB數(shù)據(jù)庫中選擇同源建模的模板序列，其氨基酸序列與CoTI的一致性大于或等于30%，使用SWISS-MODEL對CoTI進行同源建模獲得其三維結(jié)構(gòu)。使用MEGA7.0進行多序列比對，使用PyMol對其模型進行可視化分析和處理。

1.2.2 模型驗證

利用PROCHECK和Verify-3D程序?qū)δＰ瓦M行評估。Ramachandran plot用于闡述肽平面內(nèi)兩個二面角(φ與ψ)的比值，以表明氨基酸殘基的允許和不允許的構(gòu)象，通過PROCHECK 計算的 Psi/Phi Ramachandran圖來評估模型的立體化學(xué)可靠性[5]。蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基酸殘基的兼容性通過Verify-3D進行評價[6]，至少80%的氨基酸殘基得分≥0.2則通過驗證。

1.2.3CoTI基因的定點突變

定點突變采用ClonExpress公司生產(chǎn)的Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2，基于一步法[7]，利用CoTI-pET28重組載體為模板，根據(jù)W114所對應(yīng)的核苷酸設(shè)計突變引物(表1)。

表1 突變引物及其序列

PCR反應(yīng)體系總量為50 μL，在美國Applied Biosystems公司Veriti 96孔快速PCR 儀上進行。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，63 ℃退火15 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸50 s；最后72 ℃再延伸300 s。突變質(zhì)粒DNA的片段回收、酶切、克隆、轉(zhuǎn)化方法均參照文獻[8]和試劑盒說明。最后突變體菌株提取質(zhì)粒、酶切和PCR鑒定，送往成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，驗證突變的正確性。

1.2.4 突變體的表達、純化及活性檢測

(1)參照文獻[8]：突變體菌株在含卡那霉素和氯霉素的液體LB培養(yǎng)基中37 ℃、200 r/min培養(yǎng)到A600值為0.6～0.8時，加入IPTG使其終濃度為1 mmol/L，過夜誘導(dǎo)表達(27 ℃，180 r/min)。誘導(dǎo)菌液使用超聲破碎儀(總時長為30 min，超聲3 s/間隙3 s，功率45 W)進行破碎，經(jīng)Ni2+親和柱純化后得到純化突變體。(2)突變體的活性檢測參照文獻[9]：采用BAPNA(N-benzoyl-DL-arginine-p-nitroaniline)為胰蛋白酶底物，活性檢測實驗重復(fù)3次。(3)菜青蟲中腸胰蛋白酶提取方法參考文獻[9]:取4～5齡蟲固定于滴有石蠟的托盤，托盤置于冰上，截取菜青蟲中腸及其內(nèi)含物，用液氮研磨成粉末，加入150 mmol/L NaCl溶液1 mL，制成勻漿，于冰浴中抽提蛋白10 min后，使用12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液即為中腸酶液，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 突變體的熒光光譜檢測

平衡CoTI和突變體蛋白液的終濃度為1.0 mmol/L，然后用日本日立公司F-7000光度計測定相應(yīng)的吸光值。檢測條件限定為：280 nm的激發(fā)波長，激發(fā)狹縫寬度為5 nm，發(fā)射狹縫寬度為10 nm，掃描速度為1 200 nm/min，在熒光分光光度計上記錄CoTI和突變體蛋白在300～400 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比對和同源建模

Blast結(jié)果顯示：CoTI的氨基酸序列與大豆胰蛋白酶抑制劑STI(Soybean trypsin inhibitor，PDBid：1BA7)同源性最高，達到了35%的序列相似性(圖1)。因此，選擇STI作為同源建模的模板。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明：CoTI與大多數(shù)Kunitz類胰蛋白酶抑制劑一樣，由12個β折疊組成(圖1)。CoTI模型與STI的RMSD為1.33，Z Score為10.4，表明這兩者具有相似的三維整體結(jié)構(gòu)。

圖1 CoTI同源建模結(jié)構(gòu)

2.2 驗證建模模型

使用PROCHECK和Verify-3D程序?qū)oTI模型進行評估。PROCHECK計算的Psi/Phi Ramachandran圖結(jié)果表明CoTI模型的絕大多數(shù)φ、ψ二面角均處于合理范圍內(nèi)，其中允許區(qū)域占83.2%，最大允許區(qū)域占16.1%，不允許區(qū)域僅為0.7%，見圖2(a)。Verify-3D 分析結(jié)果顯示CoTI模型中有94.77%的側(cè)鏈氨基酸殘基得分在0.2以上，具體見圖2(b)。

圖2 拉氏圖(a)和 CoTI模型的Verify 3D評價圖(b)

2.3 CoTI蛋白模型分析

CoTI三維結(jié)構(gòu)由12個反向平行β-折疊和13個loop環(huán)組成(圖1)，含有兩個二硫鍵(Cys64-Cys108、Cys156-Cys164)。CoTI的抑制中心環(huán)位于β4與β5之間，活性基序為L84-V85-R86-P87-T88，在與靶蛋白酶反應(yīng)時，該Loop可能插入到胰蛋白酶的底物口袋中，從而發(fā)揮抑制作用。CoTI形成β-三葉草結(jié)構(gòu)，12個反向平行β-折疊中的6個形成底部的β-桶(β-Barrel)，其余6個β-折疊形成疏水核心頂部的蓋子(Lid)。Kunitz絲氨酸蛋白酶抑制劑β桶蛋白疏水核心的包裝是家族特異性的。CoTI的Trp114殘基位于桶蓋連接處。通過與其他Kunitz絲氨酸蛋白酶抑制劑序列(ECTI[10]、STI[11]、DE-3[12]、DrTI[13]、TKI[14]、WCI[15]、BASI[16])比對可以看出，該殘基在其他Kunitz蛋白酶抑制劑家族成員也高度保守(圖3)。并且，將CoTI模型和其他Kunitz絲氨酸蛋白酶抑制劑的三維結(jié)構(gòu)重疊比對，也可以看到Trp114在三維結(jié)構(gòu)上高度重疊。

★為保守的W114

通過分析CoTI的W114發(fā)現(xiàn)，CoTI中的W114位于LID的β6折疊始端，與Leu98和Ser137形成氫鍵，其側(cè)鏈伸向Barrel，與Leu42、Val68、Leu98、Phe100、Val126、Met127、Leu128、Phe139、Leu153和Val179形成疏水作用，從而參與三葉草結(jié)構(gòu)的包裝并決定結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性(圖4)。

與W114形成疏水作用的氨基酸用灰色表示；與W114形成氫鍵的氨基酸用白色表示(Leu98與W114既形成氫鍵，又有疏水作用)；黑色虛線代表氫鍵

2.4 突變體活性檢測

經(jīng)檢測，菜青蟲中腸蛋白酶液的比活力為2.286 IU/mg，表明菜青蟲中腸中含有胰蛋白酶。圖5表明：CoTI對牛胰蛋白酶抑制效果顯著，為204.92 UI/mg，而CoTI(W114A)突變體的抑制活力為74.97 UI/mg，相較于野生型CoTI下降了63.4%；CoTI對菜青蟲中腸胰蛋白酶也具有明顯的抑制活性，為167.728 6 UI/mg。而CoTI(W114A)突變體抑制活性下降了62%，僅為63.92 UI/mg。

2.5 突變體熒光光譜檢測

蛋白質(zhì)中的天然熒光生色團為其芳香族氨基酸(Trp、Tyr、Phe等)，其中由色氨酸殘基發(fā)出的熒光占統(tǒng)治地位。通過對CoTI和突變體進行熒光光譜檢測，由熒光光譜圖(圖6)分析可看出：CoTI(W114A)發(fā)生了輕微藍移(342.8 nm藍移至340.4 nm)，熒光強度由318.2減弱到216.2，減弱了32%，可能原因是114位的色氨酸突變?yōu)楸彼岷?，減少了蛋白質(zhì)中的天然熒光發(fā)色團，故熒光強度降低，且發(fā)生突變后，疏水腔內(nèi)相互作用力減小，使得三維結(jié)構(gòu)更加緊湊。

圖6 CoTI與突變體的熒光光譜

3 討論與結(jié)論

盡管KPI家族成員的氨基酸序列保守性不高，但卻具有相似的三級結(jié)構(gòu)，可能原因是β折疊上的若干疏水氨基酸之間形成的分子間相互作用。通過同源建模方法，獲得CoTI的三維模型，發(fā)現(xiàn)其三維模型為典型的β-三葉草結(jié)構(gòu)，其中6個形成β-桶，另外6個形成封閉桶上方的蓋子，此結(jié)構(gòu)為β-三葉草結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的常見基序。分析CoTI疏水核心，發(fā)現(xiàn)Trp114在Kunitz家族中是高度保守的，其位于β-桶與蓋子的連接點處，不僅與Leu98和Ser137形成氫鍵，而且疏水側(cè)鏈伸向β桶內(nèi)部，與鄰近的氨基酸Leu42、Val68、Leu98、Phe100、Val126、Met127、Leu128、Phe139、Leu153和Val179產(chǎn)生疏水作用。W114通過這些相互作用，緊緊地將蓋子與桶的頂層縫合在一起，從而參與β-三葉草整體結(jié)構(gòu)的維系并保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

向緬等[8]曾做過CoTI(R86D)突變體的表達及活性檢測，結(jié)果相較于野生型，突變體對胰蛋白酶抑制活性下降了93%，從而證實Arg86為CoTI抑制胰蛋白酶的關(guān)鍵殘基，且在發(fā)揮抑制作用的過程中起決定性的作用。而本實驗通過對CoTI中W114進行單定點突變后發(fā)現(xiàn)：無論是對牛胰蛋白酶還是菜青蟲中腸胰蛋白酶的抑制活性，突變體較野生型都發(fā)生明顯下降，但抑制活性下降并沒有CoTI(R86D)大，可能原因是Arg86作為CoTI與胰蛋白酶作用的關(guān)鍵殘基，對發(fā)揮抑制作用至關(guān)重要，而W114則主要是作為維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵殘基，間接的影響抑制作用的發(fā)揮。熒光光譜檢測發(fā)現(xiàn)，W114作為疏水腔內(nèi)關(guān)鍵的氨基酸，當(dāng)發(fā)生突變后，會使CoTI的整體構(gòu)象發(fā)生改變。我們推測：Trp114殘基突變?yōu)锳la殘基后，原有的氫鍵與疏水作用隨即減弱，甚至消失，會使整體結(jié)構(gòu)趨于不穩(wěn)定，進而影響抑制中心的構(gòu)象，導(dǎo)致W114A突變體與靶蛋白酶的結(jié)合變?nèi)?，從而?dǎo)致抑制活性的下降。研究證實W114是CoTI疏水核心中的一個關(guān)鍵殘基，其在CoTI蛋白的折疊形成過程以及發(fā)揮抑制活性中起到了重要的作用，該結(jié)果為CoTI的結(jié)構(gòu)功能研究及相關(guān)的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。