高效液相色譜法快速測定臘肉中苯并芘的含量

李單單

河南進口肉類指定口岸漯河查驗區(qū)服務中心 河南漯河 462000

臘肉是湖北、四川、湖南、江西、云南、貴州、甘肅隴西、陜西的特產，已有幾千年的歷史。其基本做法是將一定比例的食鹽和多種香辛料混合放在肉中進行腌制7～15d，然后把肉串掛起來，把水滴干，再用柏樹枝、甘蔗皮、椿樹皮或柴草火熏烤，隨后掛起來用煙火慢慢熏干而成。煙熏的主要目的是賦予臘肉特有的色澤和風味。但在高溫條件下熏材的不完全燃燒會產生一種致癌性較強的化學物質苯并芘，煙熏溫度越高，產生的致癌物就越多。

苯并芘(Benzopyrene)是一種含苯環(huán)的稠環(huán)芳烴，在環(huán)境中廣泛存在[1]。苯環(huán)的稠合位置不同，苯并芘分為2種，苯并[a]芘(1，2-苯并芘)和苯并[e]芘(4，5-苯并芘)。常見的是苯并[a]芘，英文縮寫B(tài)[a]P，CAS號為50-32-8，化學式為C20H12，分子量為252.31。常溫下狀態(tài)為黃色粉末，熔點為179℃，溶解度方面難溶于水，微溶于甲醇、乙醇，易溶于苯、甲苯、二甲苯、丙酮、乙醚、氯仿、二甲基亞砜等有機溶劑。最初由煤焦油中分離得到，從煤煙、焦油、瀝青、香煙煙霧中都可以查出，有強烈的致癌作用，可以誘發(fā)肺癌，其在大氣中的含量已經(jīng)列入環(huán)境監(jiān)測的常規(guī)項目[2]。動物實驗證明，苯并芘具有致癌、致畸和致突變型，其在食品、油脂、水體和土壤中廣泛存在。4，5-苯并芘(苯并[e]芘)是1，2-苯并芘的同分異構體，存在于煤煙和焦油中。苯并芘在工業(yè)上無生產和使用價值，一般只作為生產過程中形成的副產物隨廢氣排放。最早于1933年，英國科學家J.W.Cook等人從瀝青中分離得到苯并芘純品，合成證明了其化學結構，并進行動物實驗，誘導小鼠產生了皮膚癌，由此，苯并芘被確認為是第一個化學環(huán)境致癌物[3]。

目前針對苯并芘的測定，相關文獻中多采用酶聯(lián)免疫吸附測定法[4]、膠體金法[5]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法[6]、液相色譜-質譜聯(lián)用法[7]、液相色譜-熒光檢測法等[8～16]。采用食品安全國家標準GB 5009.7-2016《食品安全國家標準食品中苯并[a]芘的測定》中的液相色譜法測定苯并[a]芘時，由于臘肉的油脂多且成分復雜，苯并[a]芘的加標回收率低、且結果不好重現(xiàn)，因此需要建立一種有效快速測定臘肉中苯并[a]芘含量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

高效液相色譜儀Waters Acquity Arc，美國沃特世科技有限公司，配waters2475熒光檢測器；

色譜柱Cortecs-C18(4.6×50mm，2.7μm)；

固相萃取柱BaP-2，月旭科技；

固相萃取柱Silica，月旭科技；

固相萃取儀，美國安捷倫科技有限公司；

電子分析天平ML204T，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；

氮氣發(fā)生器LCMS30-1-E，英國Parker；

氮吹儀N-EVAP 24，美國Organomation；

多位渦旋振蕩器，廣東晉元；

超聲波清洗器，中國昆山舒美；

有機濾膜0.22μm，天津津騰公司。

1.2 試劑

分析純二氯甲烷，天津市科密歐化學試劑有限公司；

分析純正己烷，天津市科密歐化學試劑有限公司；

色譜純乙腈，上海安譜實驗科技股份有限公司；

實驗用水為Milli-Q Advantage A10超純水，美國Millipore公司。

1.3 標準曲線的繪制

1.3.1 標準物質

苯并芘，純度99.6%，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3.2 標準儲備液

準確稱取一定量的苯并芘標準品，用乙腈定容至100mL，配制成1μg/mL的標準儲備液。

1.3.3 標準工作液

吸取適量標準儲備液，用乙腈+水=90+10稀釋成濃度為100ng/mL的標準工作液，然后經(jīng)過逐級稀釋，用乙腈+水=90+10配制成濃度分別為0.4、1、2、4、8ng/mL的系列工作溶液。

1.4 樣品前處理過程

1.4.1 樣品提取

稱取5g(精確至0.001g)已粉碎均勻的樣品于50mL離心管中，加入10mL正己烷渦旋混合10min，40℃下超聲提取10min，以6 000r/min轉速于4℃冷凍離心5min，轉移出上清液，再加入10mL正己烷重復提取一次。合并上清液待凈化。

1.4.2 凈化

依次用5mL二氯甲烷、5mL正己烷活化Silica-BaP-2串聯(lián)柱，加入待凈化液16mL，棄去全部流出液；加入5mL正己烷淋洗整個串聯(lián)柱，然后棄去上面Silica硅膠柱，用5mL正己烷淋洗下面BaP-2柱，然后加入6mL二氯甲烷洗脫液，收集洗脫液并抽干，在洗脫液中加入0.5mL乙腈，40℃下氮吹至近干。然后用乙腈+水=90+10定容至1mL，供上機檢測。

1.4.3 儀器條件

色譜柱：Cortecs-C18(4.6×50mm，2.7μm)。

流動相：乙腈+水=90+10。

流速：0.5mL/min。

柱溫：35℃。

進樣量：10μL。

檢測波長：激發(fā)384nm，發(fā)射406nm。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

試驗考察了C18色譜柱規(guī)格分別為(4.6×250mm,5μm)、(4.6×50mm，2.7μm)時對測定結果的影響。結果顯示：在使用第一種色譜柱時，柱壓較高，保留時間為16min，不利于樣品的批量快速測定；在使用第二種色譜柱時，不僅能滿足實驗要求，且保留時間較短(3min左右)，能大大節(jié)省檢測時間，因此試驗選擇C18色譜柱的規(guī)格為(4.6×50mm，2.7μm)。

試驗進一步考察了標準系列和樣品最后定容的溶劑對峰的影響。結果顯示：以純乙腈作為溶劑時，其峰高比流動相作為定容溶劑時低5%，純乙腈定容時會有溶劑效應，因此最終的定容溶劑選擇和流動相一致。

同時試驗還考察了流動相中水和乙腈的比例分別為30∶70、20∶80、12∶88、10∶90、8∶92時對峰的影響。發(fā)現(xiàn)隨著水的比例減少，目標峰出峰時間提前了，雖節(jié)省了檢測時間，但水的比例過低時，雜峰增加，目標峰出現(xiàn)拖尾，且響應值降低。綜合考慮，試驗最終選擇10∶90作為流動相。

按照1.4優(yōu)化的前處理及儀器條件對1ng/mL苯并芘標準溶液、樣品加標(2ng/g)進行測定，得到的色譜圖見圖1。

圖1 苯并芘標準溶液(a)和樣品加標(b)色譜圖

2.2 線性關系、檢出限及定量限

苯并芘標準溶液0.4、1、2、4、8ng/mL，按照優(yōu)化好的色譜條件上機測定，得到各濃度點的色譜圖。

根據(jù)色譜圖，做出標準溶液的濃度X與峰面積Y之間的關系。結果表明，苯并芘在5min內即可完成檢測，且在0.4～8ng/mL的標準濃度范圍內具有良好的線性關系，線性回歸方程為Y=3.40×106+5.86×104，相關系數(shù)R2=0.9999，同時根據(jù)信噪比S/N=3和S/N=10確定目標物的檢出限和定量限，苯并芘的檢出限為0.2μg/kg，定量限為0.5μg/kg。苯并芘的各濃度點色譜圖、校準曲線、相關系數(shù)、檢出限和定量限分別見圖2和表1。

圖2 各濃度點標準色譜圖(a)和校準曲線(b)

表1 苯并芘的線性范圍，回歸方程，相關系數(shù)，檢出限及定量限

2.3 精密度實驗

以苯并芘標準溶液2ng/mL，按照1.4.3的儀器條件連續(xù)進樣6次，測得苯并芘的保留時間和峰面積的相對標準偏差分別為0.002%和0.03%。結果表明該實驗的色譜條件具有良好的精密度。

2.4 樣品的加標回收率實驗

準確稱取5g制備好的臘肉樣品，分別加入苯并芘標準品1、5、10ng，每個加標點做3個，按照1.4.1和1.4.2的方法進行樣品前處理，然后按照1.4.3的方法進行上機測定計算加標回收率，測定結果見表2。結果顯示，加標平均回收率在87.86%～90.20%之間，相對標準偏差在1.0～1.3之間，表明該方法的準確度和精密度良好，能夠滿足臘肉中苯并芘含量的檢測要求。

表2 苯并芘的添加回收率、精密度(n=3)

2.5 實際樣品中苯并芘的測定

隨機從超市中購買10個品牌的臘肉，按照1.4的方法進行前處理和上機測定。每個樣品稱3份，分別測定計算其平均值，測定結果見表3。結果表明10份臘肉樣品中均含有不同量的苯并芘，但都不超限量(5μg/kg)。

表3 不同品牌臘肉中苯并芘的含量

3 討論

本試驗利用高效液相色譜法檢測臘肉樣品中的苯并芘，苯并芘的出峰時間早，節(jié)省檢測時間，分離度滿足試驗需求，既可以節(jié)省流動相中的乙腈，實用性強，又特別適合大批量樣品的檢測，可為今后臘肉中苯并芘的檢測提供可靠的數(shù)據(jù)支持。