miR-21a-5p 靶向MATN2抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究

王立剛 王 穎 王 涵

腦卒中(cerebral stroke)又稱(chēng)中風(fēng)、腦血管意外，是一種發(fā)生率、病死率及致殘率都較高的急性腦血管疾病，其中缺血性腦卒中占比高達(dá)80%，嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康[1,2]。缺血性腦卒中主要由腦部血管阻塞導(dǎo)致腦血供不足，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和興奮性毒性等病理變化導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，造成嚴(yán)重的神經(jīng)損傷[3～5]。腦卒中發(fā)生后，浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)在調(diào)節(jié)缺血性腦損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，影響腦卒中后神經(jīng)元的命運(yùn)和腦組織的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)[6,7]。重組組織纖維溶酶原激活劑(r-tPA)是目前常用的腦卒中臨床治療方案，但由于其治療時(shí)間窗窄，出血傷害風(fēng)險(xiǎn)大，限制其臨床應(yīng)用[8]。因此，深入研究腦卒中調(diào)控機(jī)制并開(kāi)發(fā)新的靶向治療方法顯得尤為重要。

miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度為21～23nt的寡核苷酸RNA，通過(guò)與RNA互補(bǔ)序列結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)特定RNA的翻譯，從而引起mRNA降解或螯合，調(diào)控多種細(xì)胞生理過(guò)程，是一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子[9,10]。最近研究表明miRNAs參與調(diào)控腦卒中病理進(jìn)程中的炎性反應(yīng)[11,12]。Zhang等[13]通過(guò)體內(nèi)體外研究發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p靶向抑制Notch表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，分泌抗炎性細(xì)胞因子IL-10和Arg-1，抑制腦卒中炎性反應(yīng)。抑制miR-15a/16-1，增強(qiáng)缺血小鼠腦中claudin-5的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，促炎性M1型巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)減少，小鼠腦梗死面積減小[14]。腦卒中早期注射miR-124，小鼠神經(jīng)元存活率顯著提高，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加，炎性反應(yīng)被抑制[15]。這些結(jié)果揭示了miRNA作為腦卒中巨噬細(xì)胞M1/M2型的調(diào)節(jié)因子的作用，同時(shí)為腦卒中診斷提供了新的標(biāo)志物。但miR-21a-5p作為炎性反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，在腦卒中病理進(jìn)程中的炎性反應(yīng)的作用機(jī)制目前尚不明確[16,17]。

本研究擬通過(guò)合成miR-21a-5p mimics轉(zhuǎn)染LPS處理的巨噬細(xì)胞，檢測(cè)miR-21a-5p對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷的影響，并對(duì)其作用的分子機(jī)制進(jìn)行探討，為腦卒中的診斷提供生物學(xué)標(biāo)志物，為靶向藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)與分組：小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞用含10% 胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibico 公司)培養(yǎng)，放置在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)中。通過(guò)LPS(美國(guó) Sigma 公司)預(yù)孵育巨噬細(xì)胞 24h，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化。細(xì)胞分組：不做任何處理的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞組為對(duì)照組；僅用LPS處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞組為L(zhǎng)PS處理組。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：2μmol/L miR-21a-5p mimics或陰性對(duì)照miRNA-NC或5μl Lip2000(美國(guó) Invitrogen公司)分別加入 OPTI-MEM(美國(guó)Gibco公司)稀釋至250μl，混合靜置15min后轉(zhuǎn)染LPS(1μg/ml)處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6h后換含10% 胎牛血清，1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

3.RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)：當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%密度時(shí)，Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)提取RNA，cDNA合成試劑盒(日本TaKaRa公司)獲得cDNA，SYBR?PrimeScriptTMⅡ RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)進(jìn)行定量檢測(cè)。采用相對(duì)定量的比較Ct法，即2-△△Ct法檢測(cè)miR-21a-5p和MATN2水平，以U6和GAPDH的表達(dá)作為內(nèi)參。引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 引物序列

4.miR-21a-5p mimics和陰性對(duì)照miRNA-NC的合成并驗(yàn)證：根據(jù)小鼠miR-21a-5p序列，合成miR-21a-5p mimics及其陰性對(duì)照miRNA-NC，轉(zhuǎn)染LPS(1μg/ml)處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)miR-21a-5p水平。

5.MTT檢測(cè)細(xì)胞活力：在96孔板中接種1×104按照一定實(shí)驗(yàn)處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞，孵育24h后，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，每孔加入500μg/ml MTT(美國(guó) Sigma 公司)孵育4h，Elx-800酶聯(lián)免疫儀(美國(guó)Bio-Tek公司)檢測(cè)570nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力改變。

6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：AnnexinV-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，收集3×104個(gè)細(xì)胞，預(yù)冷的70%乙醇4℃固定2h。離心棄去固定液，3ml PBS重懸，清洗3次。1ml PI(碘化丙啶)染液染色，4℃避光30min。FACSAria Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Biosciences公司)檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡比例。

7.ELISA檢測(cè)炎性細(xì)胞因子水平：LPS(1μg/ml)處理24h后，進(jìn)行miR-21a-5p過(guò)表達(dá)處理48h，收集細(xì)胞蛋白，ELISA檢測(cè)促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。一抗37℃孵育2h；相應(yīng)的HRP-二抗37℃孵育1.5h。OPD作為顯色底物，37℃反應(yīng)約10min。Elx-800酶聯(lián)免疫儀讀數(shù)，讀數(shù)波長(zhǎng)為490nm。

8.蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blot法)：細(xì)胞收集后用RIPA緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)冰上裂解30min，BCA(美國(guó) Hyclone 公司)測(cè)定蛋白含量，每孔加入40μg蛋白，10% SDS-PAGE 膠分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜(美國(guó)Millipore 公司)，5%的脫脂牛奶室溫下封閉1.5h，TBST洗脫3次，每次10min，用MATN2抗體孵育過(guò)夜，二抗1∶5000稀釋室溫下孵育2h。內(nèi)參選用β-actin。

9.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：據(jù)TragetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的miR-21a-5p和MATN2 3′ UTR的結(jié)合序列合成MATN2野生型熒光報(bào)告質(zhì)粒(MATN2-WT)和突變型熒光報(bào)告質(zhì)粒(MATN2-MT)，分別與miRNA-NC或miR-21a-5p mimics共轉(zhuǎn)染LPS(1μg/ml)處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞 48h，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega 公司)檢測(cè)熒光素酶活性。

結(jié) 果

1.miR-21a-5p在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中水平降低：使用不同濃度的LPS(0、0.25、0.5、1、2μg/ml)誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)miR-21a-5p水平。與對(duì)照組比較，隨著LPS處理濃度的增加，miR-21a-5p水平逐漸降低。LPS處理濃度大于1μg/ml時(shí)，miR-21a-5p水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 不同濃度LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中miR-21a-5p水平

2.miR-21a-5p mimics抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷：miR-21a-5p mimics轉(zhuǎn)染LPS(1μg/ml)處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞后miR-21a-5p水平顯著升高。上調(diào)LPS(1μg/ml)處理的巨噬細(xì)胞miR-21a-5p水平后，細(xì)胞活力顯著升高，細(xì)胞凋亡比例降低；促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平降低(圖2)。

圖2 miR-21a-5p對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的影響

3.MATN2是 miR-21a-5p直接靶基因：通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-21a-5p靶基因，發(fā)現(xiàn)MATN2是miR-21a-5p潛在靶基因(圖3A)，雙光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明miR-21a-5p mimics特異性地降低MATN2-WT熒光素酶活性(圖3B)，miR-21a-5p inhibitor促進(jìn)MATN2蛋白表達(dá)和MATN2 mRNA水平(圖3C)，miR-21a-5p mimics抑制MATN2蛋白表達(dá)和MATN2 mRNA水平(圖3D)。結(jié)果表明MATN2是miR-21a-5p直接靶基因。

圖3 miR-21a-5p靶向MATN2 mRNA的3′UTR

4.miR-21a-5p靶向MATN2抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷：MATN2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LPS(1μg/ml)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞后，MATN2蛋白表達(dá)和MATN2 mRNA水平上調(diào)(圖4A)；MTT結(jié)果表明MATN2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LPS(1μg/ml)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞活力下降，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步轉(zhuǎn)染miR-21a-5p mimics，細(xì)胞活力升高(圖4B)；流式結(jié)果表明MATN2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LPS(1μg/ml)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡比例升高，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步轉(zhuǎn)染miR-21a-5p mimics，細(xì)胞凋亡比例下降(圖4中C和D)。

圖4 miR-21a-5p通過(guò)MATN2抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷

討 論

腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的疾病之一，缺血性腦卒中是由各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進(jìn)而產(chǎn)生臨床上對(duì)應(yīng)的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)，嚴(yán)重影響著患者的生存質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中發(fā)生后，浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)在調(diào)節(jié)缺血性腦損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，M1型巨噬細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β，加重中樞炎性反應(yīng)；M2型巨噬細(xì)胞分泌抗炎性細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-13 和TGF-β，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，抑制炎癥，促進(jìn)腦損傷修復(fù)[18～20]。小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)腦卒中早期，M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，抑制腦卒中后的損傷修復(fù)，腦卒中恢復(fù)期M2型巨噬細(xì)胞增多，促進(jìn)神經(jīng)元功能恢復(fù)[21,22]。

miR-21a-5p作為炎性反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，在慢性阻塞性肺疾病患者中miR-21a-5p水平降低，升高miR-21a-5p靶向抑制TNF-α-TLR4通路，減輕炎性反應(yīng)[16]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷性腦損傷中miR-21a-5p水平升高，miR-21a-5p同時(shí)影響NF-κB，Akt和Ang-1/Tie-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性抑制炎癥和凋亡來(lái)減輕受損的腦微血管內(nèi)皮屏障的滲漏[17]。本研究通過(guò)LPS處理巨噬細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化，發(fā)現(xiàn)使用不同濃度的LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞，隨著LPS處理濃度的增加，miR-21a-5p水平逐漸降低。同時(shí)，上調(diào)LPS處理的巨噬細(xì)胞miR-21a-5p水平，細(xì)胞活力顯著升高，細(xì)胞凋亡比例降低；促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平降低。

通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)MATN2是miR-21a-5p潛在靶基因，雙光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明MATN2是 miR-21a-5p直接靶基因。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白matrilin-2(MATN2)能夠通過(guò)TLR4/NF-κB接誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中促炎基因的表達(dá)，加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病[23]。另有研究者對(duì)過(guò)敏性鼻炎患者和健康人進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)抑制MATN2，能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化[24]。在LPS處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞中，下調(diào)miR-21a-5p 表達(dá)可以促進(jìn)MATN2蛋白表達(dá)和上調(diào)MATN2 mRNA水平，上調(diào)miR-21a-5p 表達(dá)抑制了MATN2蛋白表達(dá)和下調(diào)MATN2 mRNA水平。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-21a-5p在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)降低，并且證實(shí)高表達(dá)的miR-21a-5p能夠下調(diào)MATN2表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷，使得細(xì)胞活力顯著升高，降低細(xì)胞凋亡比例和促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)水平。本研究首次明確miR-21a-5p/MATN2在巨噬細(xì)胞極化中的作用，進(jìn)一步豐富了腦卒中炎性反應(yīng)的病理、生理機(jī)制，為腦卒中診斷提供分子標(biāo)志物，同時(shí)為腦卒中的靶向治療提供新的策略，具有重大的科研和臨床意義。