精漿抗苗勒管激素水平與體外受精周期中受精率的相關性研究*

冼英杰，陳潤強，李付廣，喬 靜，周秀琴，馮 玲，邱佩嫦，陳彩蓉

廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院/廣東省清遠市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，廣東清遠 511500

近年我國不孕不育夫婦的比例逐年上升，體外受精(IVF)和胚胎移植(ET)技術目前已成為不孕不育患者解決生育問題的常規(guī)有效手段。在診療過程中，對IVF受精率的預測是其中一個重要環(huán)節(jié)，目前臨床醫(yī)生主要依據(jù)精液參數(shù)對患者受精率進行評估，為患者制訂合理的助孕方案以獲得更好的臨床結局。雖然IVF技術日益進步，但IVF受精障礙仍難以避免，有5%～15%的IVF周期會發(fā)生完全受精失敗或低受精[1-2]，特別是當無胚胎可用時，不僅加重患者經(jīng)濟及身心負擔，而且增加臨床醫(yī)生和胚胎學家的壓力。因此，目前這種利用精液參數(shù)來預測精子受精能力的方法存在極大的局限性，為了最大限度保證IVF能產(chǎn)生理想數(shù)量和質量的胚胎，有效避免完全受精失敗或受精率低下，有必要尋找單一或綜合的實驗室檢測指標以更精確地預測IVF受精結局。精漿抗苗勒管激素(AMH)是轉化生長因子β超家族成員之一，由睪丸生精上皮支持細胞在卵泡刺激素(FSH)刺激下產(chǎn)生[3]，分泌過程受雄激素、促性腺激素的調節(jié)和支持細胞附近的生殖細胞分化程度的影響[4-5]。成年男性的AMH只有在支持細胞上產(chǎn)生并釋放至輸精管，文獻報道精漿AMH與睪丸生精上皮功能及精子形成的數(shù)量和質量密切相關[6-7]。最近，有研究指出精漿AMH可以作為預測IVF受精率的實驗室指標[8]，但此類研究報道極少，其對受精率的預測價值仍不明確。因此，本研究分析了接受IVF治療的不孕不育男性患者精漿AMH水平與受精率之間的相關性，利用ROC曲線評估其對受精率的預測能力，以期為臨床預測IVF結局和選擇受精方法提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選取了2018-2020年在本院生殖中心行常規(guī)IVF治療的不孕不育夫婦170對進行前瞻性研究，男女雙方年齡均≤38歲，女方卵巢功能正常且血清AMH≥1.1 ng/mL，基礎竇卵泡(AFC)≥5個，基礎FSH<10.0 ng/mL，體質量指數(shù)(BMI)18.0～24.0 kg/m2，因輸卵管因素采用長方案和拮抗劑方案進行控制性促排卵，獲卵數(shù)≥5個。男方精液分析按世界衛(wèi)生組織(WHO)第五版標準進行，正常形態(tài)精子均≥4%，將170對夫婦根據(jù)男方精液參數(shù)分為3組，正常精子組(n=55)：精子濃度(15～<50)×106/mL，前向運動精子比例(PR)≥32%；高精子總數(shù)組(n=46)：精子濃度≥50×106/mL，PR≥32%；弱精子組(n=69)：精子濃度<15×106/mL，PR為>5%～<32%。剔除標準：不明原因的不育患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(編號QPH-IRB-A0118)，患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本采集和精子分析 男方禁欲2～7 d，取卵日通過手淫收集精液到無毒無菌杯中。每1次采集的精液標本分為3份，分別用于精液分析、精漿分離后AMH檢測及IVF的精液優(yōu)選。精液標本完全液化后在60 min內(nèi)處理及分析，濃度和活力分析使用西班牙Microptic公司SCA-5精液分析儀，精子形態(tài)學分析采用Diff-Quik快速染色法在光學顯微鏡1 000倍下進行檢測。

1.2.2精漿AMH檢測 取200 μL精液高速離心15 min，吸取25 μL精漿使用商品化的定量檢測試劑盒進行AMH檢測(酶聯(lián)免疫吸附測定法，廣州康潤生物科技有限公司)，線性檢測范圍為0.06～18.00 ng/mL，超出檢測上限，則稀釋后重新檢測；低于檢測下限，則按0.06 ng/mL計算。

1.2.3控制性促排卵方案 促排卵方案有長方案和拮抗劑方案兩種。長方案：前一月經(jīng)周期20～24 d給促性腺激素釋放激素激動劑(GnRHa)0.94～1.88 mg，達到垂體降調節(jié)標準后給予促性腺激素(Gn)啟動；拮抗劑方案：于月經(jīng)周期第2～3天開始，起始劑量同長方案，Gn啟動第5或6天開始使用一次促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRH-ant) 0.25 mg/d，持續(xù)至注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)日。當優(yōu)勢卵泡達到扳機標準時，停用Gn，當晚注射HCG，34～36 h后臨床醫(yī)生在B超引導下經(jīng)陰道穿刺取卵。

1.2.4IVF和胚胎觀察 獲得的卵子在培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 h后采用過夜受精方法進行IVF，受精液精子終濃度為10萬條/毫升。受精后16～18 h觀察原核(PN)，2PN為正常受精，并可見第二極體，多PN或1PN為異常受精。正常受精卵與異常受精卵在所有卵子當中的比率即為受精率。

2 結 果

2.1各組夫婦女方基本資料的比較 各組夫婦間女方各項基本資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組夫婦女方基本資料比較

2.2各組夫婦男方基本資料及IVF受精情況的比較 正常精子組、高精子總數(shù)組和弱精子組的男方年齡、精液量和精漿AMH差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；正常精子組和高精子總數(shù)組的IVF受精率、完全受精失敗及低受精的比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；弱精子組與其他兩組相比，總精子數(shù)、精子濃度、PR、總活力、IVF受精率和完全受精失敗及低受精的比例差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組男方基本資料及IVF受精情況比較

2.3整體研究人群和各組中男方年齡、精漿AMH、精液參數(shù)與IVF受精率之間的相關性 整體研究人群中男方總精子數(shù)、精子濃度、PR、總活力、精漿AMH均與受精率呈正相關(r=0.460、0.566、0.308、0.346、0.478，P<0.05)；在弱精子組，精漿AMH及PR與受精率呈正相關(r=0.299、0.266，P<0.05)。見表3。

表3 整體研究人群和各組男方精漿AMH及精液參數(shù)與IVF受精率之間的相關系數(shù)(r)

2.4整體研究人群中精漿AMH及精液參數(shù)對IVF受精率的預測價值 精漿AMH：曲線下面積(AUC)為0.647(靈敏度83.3%，特異度42.3%，截斷點0.252 ng/mL，P=0.018)；總精子數(shù)：AUC=0.539(靈敏度63.9%，特異度46.2%，截斷點63.9×106/次，P=0.527)；精子濃度：AUC=0.595(靈敏度64.4%，特異度55.4%，截斷點39.5×106/mL，P=0.033)；PR：AUC=0.599(靈敏度90.3%，特異度30.8%，截斷點20.5%，P=0.109)；總活力：AUC=0.606(靈敏度66.7%，特異度53.8%，截斷點56.5%，P=0.085)；精漿AMH對IVF受精率的預測價值較高。

2.5弱精子組中精漿AMH及PR對IVF受精率的預測價值 精漿AMH：AUC=0.665(靈敏度60.0%，特異度72.7%，截斷點1.762 ng/mL，P=0.023)；PR：AUC=0.511(靈敏度76.0%，特異度34.1%，截斷點20.5%，P=0.881)。精漿AMH對IVF受精率的預測價值優(yōu)于PR。

2.6弱精子組精漿AMH≥1.762 ng/mL與<1.762 ng/mL患者的受精情況比較 與精漿AMH≥1.762 ng/mL的患者相比，精漿AMH<1.762 ng/mL患者的受精率顯著降低(93.15%vs.70.92%P<0.01)，完全受精失敗及低受精比例明顯升高[0vs.15.91%,P<0.01]。

3 討 論

男性AMH是睪丸生精上皮支持細胞分泌的細胞因子，對男性生殖系統(tǒng)的分化、發(fā)育及成熟發(fā)揮重要的作用。AMH是精子形成的標志物，深度參與人類生殖的過程，是男性不育的重要影響因子之一。有學者對少、弱精子癥患者接受重組人卵泡刺激素(rhFSH)治療是否有反應性進行研究，結果顯示基礎精漿AMH水平高的患者對治療的反應性較AMH水平低的患者高，治療后其受精率及妊娠率顯著升高[9]。有研究認為，AMH可能存在保護精子免受損害的機制，可以作為少、弱精子癥患者冷凍精液復蘇后精子復蘇率及精子活力的預測指標[10]。王彥飛等[8]報道，精漿AMH與少、弱精子癥患者的IVF受精率呈正相關，對受精率的預測價值高于精液參數(shù)。本研究顯示，在整體研究人群中，精漿AMH和精液參數(shù)如總精子數(shù)、精子濃度、PR及總活力均與IVF受精率呈正相關，精漿AMH的AUC大于各精液參數(shù)的AUC，表明精漿AMH對IVF受精率的預測有較高的價值。正常精子組和高精子總數(shù)組精漿AMH及精液參數(shù)與受精率沒有明顯相關性，可能是由于這兩組受精率都比較高，沒有發(fā)生完全受精失敗及低受精，因此相關性不明顯。但在弱精子組，精漿AMH及PR與受精率呈正相關，精漿AMH的AUC大于PR，表明弱精子癥患者精漿AMH對IVF受精率的預測價值優(yōu)于PR，與王彥飛等[8]的研究結論一致。精子和卵子在體外結合受精是一個復雜的過程，快速前向運動精子是受精的主力，而在弱精子組精漿AMH水平與IVF受精率呈正相關，提示在弱精子癥患者中AMH可能以某種形式參與了精子運動性的調節(jié)。

目前主要的常規(guī)IVF受精方法是過夜受精，但其較高的完全受精失敗及低受精風險使醫(yī)生及胚胎學家在臨床應用上仍較謹慎。而另一種受精方法——短時受精，已有大量研究數(shù)據(jù)證實其可以有效避免完全受精失敗的發(fā)生[11]，但是早拆卵的操作及補救卵胞質內(nèi)單精子注射(ICSI)可能會引起多精受精增加[12-13]，且其較高的早補救率不僅使患者經(jīng)濟和精神壓力增大，同時也會增加實驗室胚胎學家的工作負擔和壓力，限制了其在臨床上的大規(guī)模應用。本研究顯示，弱精子組的受精率、完全受精失敗率及低受精比例均明顯低于正常精子組和高精子總數(shù)組，與文獻[14-15]報道一致。其原因可能為弱精子癥患者存在DNA碎片及頂體酶活性異常的精子比例增高，具備正常受精能力的精子不能達到卵子受精所需要的濃度[16-18]。正常精子組和高精子總數(shù)組的精漿AMH及精液參數(shù)與受精率無明顯相關性，兩組的受精率分別為91.28%和92.54%，提示本研究在對男女性患者的基本條件進行嚴格限制后，只要精液參數(shù)達到正常標準及以上時，單純的精液參數(shù)或精漿AMH水平的波動不會明顯影響IVF受精率。因此，對于患者夫婦中女方基礎條件較好(達到本研究設定的標準)，精液參數(shù)正常的患者在IVF周期中可以使用過夜受精方式進行授精。而弱精子癥患者宜使用短時受精加早拆卵技術以防止完全受精失敗情況發(fā)生，特別是當精漿AMH<1.762 ng/mL時，受精率明顯降低，完全受精失敗及低受精比例明顯升高。

本研究的優(yōu)勢在于前瞻性設計、樣本的盲法評價及根據(jù)受精前精液參數(shù)對3組患者進行分層分析，局限性為本研究樣本量較少，志愿參與者均為在生殖中心進行IVF治療的患者，可能不代表典型的供精者。AMH測定方法仍處于發(fā)展階段，酶聯(lián)免疫吸附測定法通過標準曲線計算出的樣本濃度可能低于實際數(shù)值。

綜上所述，本研究表明在整體研究人群和弱精子癥患者中，精漿AMH的濃度與IVF受精率有顯著相關性，可用于預測精子和卵子在體外結合受精的情況。同時精漿AMH的測定可以幫助醫(yī)務工作者在實際臨床工作中識別風險較高的精液樣本，特別是有助于弱精子癥患者選擇合適的受精方法。