柱前衍生化HPLC法測(cè)定柊葉游離氨基酸成分及風(fēng)味評(píng)價(jià)

黃元河，黃玉鐲，潘喬丹，*，陸海峰，黃 健

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西百色533000;2.右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西百色533000)

柊葉(Phrynium capitatum Willd.)別名粽葉，粽粑葉，為竹芋科多年生草本植物［1］，具有清熱解毒、涼血止血的功效［2］，根莖用于治療肝腫大、痢疾、赤尿，葉清熱利尿功效，治音啞、喉痛、口腔潰瘍，解酒毒等［1－2］。柊葉味道清甜，在我國(guó)廣西、云南、貴州等地區(qū)少數(shù)民族常將其栽種于庭院，取葉裹米棕或包物用，能夠提高粽子風(fēng)味，改善糯米的黏膩，增強(qiáng)糯米益氣健脾的功效。柊葉還具有防腐的功能，其葉包裹的粽子可保存數(shù)月，是有極大開發(fā)價(jià)值的粽子天然包裝材料［3］。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，是維持生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是人體的必需營(yíng)養(yǎng)成分之一，對(duì)機(jī)體代謝具有非常重要的作用［4－5］。氨基酸還在食品的呈味方面扮演重要角色，這些氨基酸被稱為呈味氨基酸，根據(jù)氨基酸的味覺(jué)感受，可以分為鮮味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸［6－9］。

目前氨基酸的分析方法有很多種，主要包括氨基酸自動(dòng)分析儀［10］、高效液相色譜法［11］、毛細(xì)管電泳法［12］等，其中柱前衍生高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)法由于靈敏度高、重復(fù)性好，操作費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為測(cè)定氨基酸的主要方法［13］。以異硫氰酸苯酯(PITC)作為衍生試劑，其產(chǎn)物單一穩(wěn)定、易于檢測(cè)，已成為一種常用的氨基酸衍生方法，已廣泛用于檢測(cè)蔬菜［14］、水果［15］、藥材［16］等。

迄今為止有關(guān)柊葉中氨基酸含量分析的資料尚未見報(bào)道，因此本文建立一種柱前衍生高效液相色譜同時(shí)測(cè)定柊葉游離氨基酸的方法，測(cè)定氨基酸種類和含量，根據(jù)FAO/WHO理想模式為評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)［17］評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和呈味特性，為深入開發(fā)利用柊葉提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柊葉6批次樣品 都購(gòu)置百色市右江區(qū)大菜市場(chǎng)不同商戶，經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院黃元河副教授鑒定為竹芋科植物柊葉(Phrynium capitatum Willd.)的葉。柊葉干燥箱60℃烘干后，粉碎處理，過(guò)60目篩，粉末4℃保存待用;三乙胺、乙腈、異硫氰酸苯酯 均為色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;濃鹽酸、無(wú)水乙酸鈉、冰乙酸 均為分析純，天津市西隴化工廠有限公司;超純水 自制;18種氨基酸［天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、半光氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、賴氨酸(Lys)］純度均大于98.0%，上海源葉生物科技有限公司。

LD－20ADIT型高效液相色譜儀、Shim－pack VP－ODS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)島津企業(yè)管理中國(guó)有限公司;KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀有限公司;FA1104型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;TGL－15B型高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;RE－3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;Mill－Q超純水機(jī) 美國(guó)密理博。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液制備與衍生化

1.2.1.1 樣品溶液制備 精密稱定柊葉粉末2.0 g，加入50%的乙醇溶液200 mL，超聲(300 W，100kHz)取兩次，每次30 min，抽濾去渣取合并濾液，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器80℃水浴揮至近干，用超純水定容至10 mL，即得柊葉樣品溶液［18］。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 分別稱取Asp 22.0 mg、Glu 22.0 mg、Ser 12.0 mg、Gly 12.0 mg、His 22.0 mg、Arg 6.0 mg、Thr 12.0 mg、Ala 12.0 mg、Pro 12.0 mg、Tyr 11.0 mg、Val 11.0 mg、Met 11.0 mg、Cys 11.0 mg、Ile 12.0 mg、Leu 11.0 mg、Phe 12.0 mg、Trp 11.0 mg，Lys 12.0 mg、加0.1 mol/L鹽酸溶液，置于50 mL容量瓶定容，即得氨基酸混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.1.3 空白液制備 以0.1 mol/L鹽酸溶液作為空白液。

1.2.1.4 衍生化處理 精密吸取樣品溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液和空白液，400μL置于1.5 mL離心管中，加入1 mol/L的衍生試劑A(1 mol/L三乙胺乙腈)200μL，衍生試劑B(0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液)200μL，混勻，室溫避光放置1 h，加入正己烷800μL，混勻，12000 r/min離心5 min，取下層溶液，0.22μm濾膜過(guò)濾，超聲5 min，即得衍生化溶液［19］。

1.2.2 色譜條件 采用Shim－Pack VP－ODS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流動(dòng)相A為0.1%醋酸鈉緩沖溶液(p H6.5)－乙腈(93∶7)，流動(dòng)相B為乙腈－水(4∶1);梯度洗脫條件為0 min，0%B;11 min，7.0%B;13.9 min，12.0%B;14 min，15.0%B;29 min，34.0%B;32 min，50%B;37 min，100%B;50 min，0%B，流速1.0 mL/min，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm時(shí)，18種氨基酸能有效分離，峰型理想;樣品進(jìn)樣量為20μL［20］。

1.2.3 氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與風(fēng)味評(píng)價(jià) 氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值采用1973年FAO/WHO建議的氨基酸評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括必需氨基酸含量占總氨基酸含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(EAA/TAA)、必需氨基酸含量占非必需氨基酸含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(EAA/NEAA)和必需氨基酸的組分分析［17］。氨基酸的風(fēng)味評(píng)價(jià)采用呈味氨基酸的含量和風(fēng)味貢獻(xiàn)強(qiáng)度，氨基酸風(fēng)味貢獻(xiàn)強(qiáng)度采用味覺(jué)閥值比(ratio of content and taste threshold，RCT)來(lái)評(píng)價(jià)，RCT=某風(fēng)味氨基酸含量/相應(yīng)氨基酸的味覺(jué)閥值［21］。

表1 18種氨基酸的線性回歸方程Table 1 The linearity relationships of 18 amino acids

1.3 數(shù)據(jù)處理

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用WPS Office表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0、2.5、3.5、4.5 mL，分別置于5 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，精密吸取上述系列溶液各400μL于1.5 mL離心管中，制備衍生化溶液。按照色譜條件進(jìn)樣分析。分別以氨基酸質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。18種氨基酸的線性方程、線性范圍、決定系數(shù)R2、檢出限和定量限見表1，色譜圖見圖1。

圖1 柊葉氨基酸高效液相色譜圖Fig.1 Phrynium capitatum Willd.amino acid HPLC

由表1可知，18種氨基酸線性方程線性范圍在0.307～440.0μmol/L，R2都在0.9990以上，結(jié)果良好。圖1顯示經(jīng)過(guò)衍生化處理后，在該色譜條件下，18種氨基酸峰型良好，分離清晰。

2.2 穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

參考趙巖等［18］方法，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取柊葉供試品衍生化溶液，分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，測(cè)定各氨基酸的峰面積計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差(RSD，relative standard deviation);精密度實(shí)驗(yàn)取衍生化標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果18種氨基酸的峰面積RSD;重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批柊葉6份，進(jìn)行衍生化處理，按色譜條件，進(jìn)樣分析，計(jì)算18種氨基酸含量，分析18種游離氨基酸百分含量RSD值，結(jié)果見表2。

由表2可知，在不同時(shí)間進(jìn)樣，18種氨基酸峰面積的RSD(n=8)在0.78%～3.0%，表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定;連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示18種氨基酸的峰面積RSD(n=6)在0.18%～2.4%之間，表示儀器的精密度良好;同一批柊葉6份18種氨基酸含量百分含量RSD(n=6)在0.59%～2.3%之間，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3 回收實(shí)驗(yàn)

取柊葉供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液按1∶4比例取樣400μL，進(jìn)行衍生化處理、進(jìn)樣分析，平行測(cè)定6次，分別計(jì)算各氨基酸含量的回收率和RSD。18種游離氨基酸的回收率平均在98.3%～105.6%之間，RSD在0.63%～3.11%之間，各種氨基酸的回收率都在98%以上，說(shuō)明該測(cè)定方法較好，結(jié)果見表3。

2.4 氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與風(fēng)味評(píng)價(jià)

2.4.1 氨基酸營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià) 取6批次柊葉樣品，制備衍生化溶液，進(jìn)樣測(cè)定18種類氨基酸含量。采用FAO/WHO的模式標(biāo)準(zhǔn)對(duì)柊葉游離氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)。柊葉游離氨基酸含量見表4和表5，色譜圖見圖1。

表2 穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的RSD值(%)Table 2 RSD values of stability，precision and repeatability experiments(%)

由表4可知，柊葉含有18種游離氨基酸和8種人體必需氨基酸。根據(jù)FAO/WHO的模式標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)氨基酸組成中EAA/TAA應(yīng)在40.0%左右，EAA/NEAA應(yīng)該在60.0%以上［9］。根據(jù)分析柊葉樣品，EAA/TAA為38.85%左右，EAA/NEAA為61.15%以上，基本達(dá)到了FAO/WHO模式標(biāo)準(zhǔn)的要求。

表5顯示，柊葉Leu和Lys的組分分別為2.9%和2.4%，低于WHO/FAO氨基酸模式譜外，其余氨基酸組分均高于WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式;所有必需氨基酸組分同時(shí)達(dá)到WHO/FAO氨基酸成人模式的需求，這說(shuō)明柊葉必需氨基酸含量配比較為合理，營(yíng)養(yǎng)較全面，是較好的植物蛋白。

2.4.2 風(fēng)味評(píng)價(jià)氨基酸 除了營(yíng)養(yǎng)作用之外，對(duì)食物口感和品質(zhì)方面起到重要作用。這些呈味氨基酸依據(jù)其的味覺(jué)強(qiáng)度，大致可分為鮮味氨基酸(Asp、Glu、Lys)、甜味氨基酸(Thr、)、Ser、Gly、Ala、His、Pro)、苦味氨基酸(Val、Met、Ile、Leu、Arg)和芳香族氨基酸(Cys、Tyr、Phe)苦味氨基酸四大類［22］，這些呈味氨基酸在食品體系中的風(fēng)味作用取決于各類氨基酸的含量和貢獻(xiàn)度(RCT)，當(dāng)RCT＜1時(shí)，表示該物質(zhì)對(duì)風(fēng)味無(wú)貢獻(xiàn)，RCT≥1時(shí)，對(duì)風(fēng)味有貢獻(xiàn)［21］。6批次柊葉各種呈味氨基酸的含量以及RCT見表6。

表6可以看出，柊葉中含有17種呈味氨基酸，總含量為23.03 mg/g。其中鮮味氨基酸Asp含量最高，甜味氨基酸Thr其次，芳香族氨基酸Cys最低。各類呈味氨基酸含量中，鮮味氨基含量為5.20 mg/g，占呈味氨基酸總含量22.58%;甜味氨基酸含量為10.73 mg/g，占46.59%，苦味氨基 酸4.47 mg/g，占19.41%。3種鮮味氨基酸的RCT均＞1，其中Asp的RCT=125.00，對(duì)鮮味貢獻(xiàn)度最大;6種甜味氨基酸中除了Gly的＜1，其余氨基酸的RCT均＞1，其中His和Ala的RCT分別為2.30和1.85，對(duì)甜味的貢獻(xiàn)度較大;5種苦味氨基酸中，除了Leu對(duì)的RCT＜1，其它氨基酸RCT均＞1，其中Arg貢獻(xiàn)度最大;芳香族氨基酸Tyr和Phe的RCT均＜1較大，而Cys的RCT=20.50，對(duì)香味的貢獻(xiàn)度最大。綜合分析，柊葉中鮮味氨基酸和甜味氨基酸含量大，鮮味氨基酸、甜味氨基酸和芳香族氨基酸對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)度高。

表4 柊葉中游離氨基酸的含量測(cè)定結(jié)果(n=6，干樣品)Table 4 Results of the determination of free amino acids in Phrynium capitatum(n=6，dry sample)

表5 柊葉各種必需氨基酸的組分分析Table 5 Composition and comparative analysis of essential amino acids in Phrynium capitatum(%)

表6 柊葉呈味氨基酸含量和組分分析Table 6 Analysis the content and constituent of flavor amino acid in Phrynium capitatum

3 結(jié)論

本研究采用柱前衍生化HPLC法測(cè)定柊葉游離氨基酸含量，色譜圖顯示在本色譜條件下18種氨基酸分離良好，基線分離。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，該方法簡(jiǎn)單易于操作，且穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。氨基酸營(yíng)養(yǎng)組分分析顯示，柊葉含有8種人體必需氨基酸，EAA/TAA為38.85%，EAA/NEAA都在60%以上，各種必需氨基酸組分達(dá)到WHO/FAO氨基酸成人模式的需求;這說(shuō)明柊葉氨基酸含量配比較為合理，營(yíng)養(yǎng)較全面，是較好的植物蛋白。風(fēng)味分析顯示，鮮味氨基酸和甜味氨基酸分別為10.73和5.20 mg/g，占呈味氨基酸總含量22.58%和46.59%，其中鮮味氨基酸Asp和甜味氨基酸Thr含量較高，分別為3.75和3.33 mg/g，鮮味氨基酸Asp和芳香族氨基酸Cys的RCT值最高分別為125.00和20.50，對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)最高，可以選擇鮮味氨基酸Asp和Glu，甜味氨基酸His和Ala，以及芳香族氨基酸Cys作為其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?？傊畺叭~氨基酸種類齊全，比例合理，呈味氨基酸含量豐富，具有極大開發(fā)價(jià)值。