鞘氨醇-1-磷酸干預對小鼠玻璃化凍融卵巢移植后凋亡的影響

秦 天，田 媛，楊延周，張淑雅，王燕蓉，裴秀英，3

（1.寧夏醫(yī)科大學生育力保持教育部重點實驗室，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學學系，銀川 750004；3.寧夏回族自治區(qū)生殖與遺傳重點實驗室，銀川 750004）

隨著癌癥診療技術(shù)的發(fā)展，癌癥患者的存活率有了較大的提高。而惡性腫瘤也呈現(xiàn)出低齡化趨勢，約4%的女性惡性腫瘤確診時不到35歲，大約75%的年輕女性癌癥患者未來仍有生育愿望[1]。然而，包括化療和放療在內(nèi)的癌癥治療可能會損害癌癥幸存者的卵巢功能和未來的生育能力。研究表明，40%~80%的女性腫瘤患者會面臨不孕的風險[2]。因此，為了恢復年輕腫瘤患者未來的生育能力和內(nèi)分泌功能，這些癌癥患者可進行卵巢組織冷凍保存（ovarian tissue cryopreservation，OTC）[3]。卵巢組織玻璃化冷凍保存是一種借助玻璃化凍存液通過快速冷卻，使細胞處于玻璃化狀態(tài)從而避免冰晶形成的技術(shù)，該技術(shù)易于執(zhí)行，可以簡單、快速地保存復雜結(jié)構(gòu)[4-5]。但凍存過程中的卵泡丟失及損傷仍是該技術(shù)面臨的巨大挑戰(zhàn)[6]。卵巢組織凍存過程中的損傷以及移植后血管的再生是觸發(fā)卵泡凋亡的關鍵步驟，而凋亡是卵泡閉鎖的重要原因[7]。如果細胞凋亡程序可以被抵抗，細胞死亡可能被阻止[8]。鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）是一種重要的具有生物活性的鞘氨脂，可調(diào)節(jié)多種細胞增殖過程，包括細胞生長和細胞分化[9]，并平衡由神經(jīng)酰胺水平升高而導致的細胞凋亡[10]。小鼠實驗表明，注射S1P可以保護卵巢免受放射治療引起的損傷[11]。在本研究中，本文旨在評估S1P對小鼠玻璃化凍融卵巢移植后卵泡凋亡的影響，為抑制凍存卵巢移植后凋亡提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物21日齡及6～8周齡清潔級ICR雌性小鼠，購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心［許可證號：SCXK（寧）2020-0001］，所有涉及的動物實驗及程序均獲得寧夏醫(yī)科大學實驗動物福利倫理審查委員會的批準，并嚴格按照國家研究委員會實驗動物護理和使用指南的要求進行實驗。實驗動物移植后暫時飼養(yǎng)于動物周轉(zhuǎn)單元。光照時間周期為12 h照明/12 h黑暗，動物室室溫保持在22～24℃，濕度保持在40%～50%，自由取食飲水，定期更換鼠籠和墊料并消毒。

1.1.2 主要試劑S1P（sigma，型號：S9666），DMEM/F12培養(yǎng)基（HyClone公司），二甲基亞砜（DMSO）（MP Biomedicals公司，型號：196055），牛血清白蛋白（BSA）（Solarbio公司，型號：A8020），1%戊巴比妥鈉，組織冰凍包埋劑（美國SAKURA公司），HE試劑盒（LEAGENE公司，型號：DH0006），TUNEL檢 測 試 劑 盒（Vazyme公司，型號：A113-02），DAPI溶液（Solarbio公司，型號：C0065），Trizol（Ambion公司，型號：15596206），5x AII-In-One RTMasterMix（abm公司），EvaGreen 2x QPCR MasterMix-Low ROX（abm公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 液體的配制 基礎培養(yǎng)液：DMEM/F-12培養(yǎng)基+1%青霉素-鏈霉素+1% DMSO；培養(yǎng)液：含有10%牛血清白蛋白（BSA）的基液；預平衡液：含有1.5 mol·L-1乙二醇（EG）的基液；玻璃化液：實驗室自主研發(fā)的EG5.5-30玻璃化液。復蘇液一、復蘇液二、復蘇液三：分別含0.5 mol·L-1、0.25 mol·L-1、0.125 mol·L-1的蔗糖液。

1.2.2 卵巢的獲取21日齡ICR雌性小鼠按體質(zhì)量（0.1 mL/10 g）腹腔注射1%戊巴比妥鈉，待麻醉之后頸椎脫臼處死，用75%酒精棉球擦拭背部皮毛，剪開小鼠背部皮膚及背膜，剝離雙側(cè)完整卵巢。

1.2.3 實驗分組 新鮮對照組；凍存對照組；S1P干預組（凍存及解凍過程全程添加2μmol·L-1S1P）。每組24枚卵巢，移植的2 d及14 d各12枚卵巢，6枚進行HE染色后的卵泡百分比計數(shù)，另外6枚進行TUNEL法及q-PCR法檢測凋亡。

1.2.4 玻璃化凍存及解凍過程 將各凍存液于37℃CO2培養(yǎng)箱中提前預熱1 h，將卵巢隨機置于各組（n=24）的培養(yǎng)液中培養(yǎng)1 h，再放入預平衡液中7 min，接著在玻璃化液3 min之后迅速投入液氮罐中保存，凍存至少3 d以后，將卵巢從液氮中取出復蘇，置于37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)預熱的復蘇液一、復蘇液二、復蘇液三各10 min，最后放入培養(yǎng)液中置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。

1.2.5 卵巢腎被膜下移植 將6～8周齡雌鼠按0.1 mL/10 g小鼠體質(zhì)量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，75%酒精擦拭背部，剔除背部絨毛，剪開約1.5 cm皮膚，剪開腎臟兩側(cè)的肌膜約0.5 cm，找到卵巢及腎臟，摘除卵巢并結(jié)扎輸卵管以去勢；在體視顯微鏡下輕柔緩慢的將復蘇后的玻璃化凍存卵巢塞入腎被膜下?？p合傷口，等待蘇醒。分別于2 d、14 d后取材。

1.2.6 組織切片及HE染色 移植卵巢取出后，4%多聚甲醛固定過夜（18～24 h），梯度酒精脫水，石蠟包埋后連續(xù)切片（5μm），每5張切片選取1張，進行HE染色。

1.2.7 正常卵泡計數(shù)HE染色后每張切片選取5個高倍視野，根據(jù)卵泡形態(tài)計數(shù)原始卵泡、初級卵泡、正常卵泡、閉鎖卵泡的百分數(shù)，進行統(tǒng)計學分析。

1.2.8 TUNEL檢測凋亡 按照Vazyme A113-02 TUNEL試劑盒操作說明書進行。卵巢取材后冰凍切片，4%多聚甲醛溶液固定30 min，PBS清洗三次，每次5 min；輕輕去掉多余液體，用1×PBS制備濃度為0.2%的TrionX-100溶液，室溫孵育15 min；PBS溶液潤洗3次，每次5 min；滴加100μL 1×Equilibration Buffer，室溫平衡孵育30 min。然后在樣本上滴加50μL TdT孵育緩沖液，置于濕盒內(nèi)37℃孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min；用1×PBS配制濃度為2μg·mL-1的DAPI黑暗中復染5 min，PBS洗3次，每次5 min；抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡在620 nm熒光下觀察BrightRed紅色熒光；在460 nm下觀察DAPI的藍光熒光。于高倍鏡下隨機選取3個視野，統(tǒng)計凋亡細胞數(shù)量，計算凋亡指數(shù)；凋亡指數(shù)=（凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。

1.2.9 凋亡基因mRNA的檢測Trizol提取卵巢總RNA并反轉(zhuǎn)成cDNA，實驗步驟依據(jù)試劑盒要求進行；然后以cDNA為模板，β-actin作為內(nèi)參，以Caspase3、Bax、Bcl-2引物進行PCR擴增，引物序列見表1。mRNA表達水平根據(jù)2-ΔΔCt法計算。

表1 PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 S1P干預改善玻璃化凍存卵巢移植后的卵巢組織形態(tài)，維持卵泡數(shù)量

HE染色結(jié)果表明，移植2 d后，各組大卵泡形態(tài)均出現(xiàn)不同程度的變形，且不易著色，顆粒細胞稀疏成片狀，卵母細胞皺縮加重。凍存對照組卵泡閉鎖較多，S1P干預組閉鎖卵泡少于凍存對照組（P<0.01），高于新鮮對照組（P<0.01）；正常卵泡數(shù)目高于凍存對照組，低于新鮮對照組（P<0.01）。與凍存對照組相比，S1P干預組有較多的原始卵泡及初級卵泡（P均<0.05）；與新鮮對照組相比，原始卵泡及初級卵泡數(shù)目較少（P均<0.01）。見圖1、圖2A。

移植14 d后，凍存對照組卵巢結(jié)構(gòu)松散，大量卵泡丟失，隨著移植周期的延長，閉鎖卵泡增加，卵巢結(jié)構(gòu)受到嚴重打擊。與凍存對照組相比，S1P干預組卵巢結(jié)構(gòu)較完好，部分卵泡發(fā)育為有腔卵泡，正常卵泡、原始卵泡及初級卵泡數(shù)目較多（P<0.05），閉鎖卵泡較少（P<0.01）。與新鮮對照組相比，S1P干預組正常卵泡、原始卵泡及初級卵泡數(shù)目較少（P<0.01），閉鎖卵泡較多（P<0.01）。見圖1、圖2B。

圖1 小鼠凍存卵巢移植后卵巢組織切片HE染色

圖2 小鼠凍存卵巢移植后各級卵泡百分比（n=6）

2.2 S1P干預降低玻璃化凍存卵巢移植后的卵巢凋亡

TUNEL紅色熒光表示凋亡細胞，移植2 d后，凋亡主要集中于大卵泡的顆粒細胞中，與凍存對照組相比，S1P干預組熒光強度明顯減弱，與新鮮對照組相比，熒光較強。見圖3A。各移植組卵巢組織細胞凋亡率表明：S1P干預組卵巢凋亡率低于凍存對照組（P<0.01），而高于新鮮對照組（P<0.01）。可見凍融過程中添加S1P后有效抑制了凍融卵巢移植后顆粒細胞的凋亡。見圖3B。

圖3 小鼠凍存卵巢移植2 d后卵巢組織TUNEL染色

2.3 Real-time PCR檢測凋亡基因Caspase3、Bax、Bcl-2的表達

Real-time PCR結(jié)果表明，移植2 d后，S1P干預組凋亡基因Caspase3及促凋亡基因Bax mRNA表達均低于凍存對照組（P<0.01），但高于新鮮對照組（P<0.01）；抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達高于凍存對照組（P<0.05），而低于新鮮對照組（P<0.05）。移植14 d后，S1P干預組Caspase3、Bax mRNA表達低于凍存對照組（P<0.05），但高于新鮮對照組（P<0.05）；Bcl-2 mRNA表達高于凍存對照組（P<0.01），低于新鮮對照組（P<0.05）。從mRNA水平上證明S1P干預組卵巢凍融移植后凋亡低于凍存對照組。見圖4。

圖4 小鼠凍存卵巢移植后卵巢Caspase3、Bax、Bcl-2 mRNA表達

3 討論

截至目前，全球通過OTC和卵巢組織移植技術(shù)（ovarian tissue transplantation，OTT）分娩的新生兒已經(jīng)超過145例[12]。在接受治療的318名患者中，95%的患者能夠恢復月經(jīng)和正常激素水平[13]。這些研究結(jié)果給眾多抗癌的年輕患者及青春期前的女孩帶來了生育的希望，但是在此技術(shù)發(fā)展的十余年，仍然處于實驗階段，面臨著巨大挑戰(zhàn)。凍存及移植過程引起的卵泡凋亡導致卵泡發(fā)育停滯和閉鎖以及移植后缺血再灌注及氧化應激引起的原始卵泡丟失是OTC和OTT面臨的兩個重要挑戰(zhàn)。S1P在哺乳動物的生理和病理過程中起著重要的作用，它調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化、細胞存活、遷移和血管生成[14]。有研究指出，細胞的生存與死亡是由神經(jīng)酰胺（Cer）、鞘氨醇（Sp）及S1P相對量的水平?jīng)Q定。Cer是一種細胞凋亡的誘導分子，細胞內(nèi)Cer水平升高能直接導致細胞凋亡[15]。應激、射線照射、細胞毒性物質(zhì)刺激等因素誘導的細胞凋亡都與細胞內(nèi)Cer水平升高有關，而S1P是一個重要的存活因子，能直接對抗Cer和Sp誘導的細胞凋亡[15-16]。S1P可顯著降低多種刺激因素如化療藥物、輻射、熱休克等誘發(fā)的卵母細胞凋亡，有效保護卵巢組織[17]。因此，本研究為了評估S1P在小鼠卵巢玻璃化凍融移植過程中是否具有抗卵泡凋亡作用，給予了凍存前、凍存及凍存后全過程的S1P干預。

HE染色形態(tài)學檢測發(fā)現(xiàn)：移植后2 d，凍存對照組及S1P干預組卵巢組織均出現(xiàn)不同程度上的大卵泡變形的情況，其顆粒細胞間質(zhì)疏松，卵母細胞出現(xiàn)固縮，絕大多數(shù)大卵泡出現(xiàn)凋亡趨勢。據(jù)文獻報道，卵巢組織在移植后的早期至少有75%的卵泡丟失[18]。本次實驗中，凍存對照組卵泡發(fā)生閉鎖，添加S1P后，與凍存對照組相比，閉鎖卵泡較少，原始及初級卵泡較多。移植14 d后，隨著移植周期的延長，凍存對照組卵巢結(jié)構(gòu)松散，大量卵泡丟失，閉鎖卵泡增加，卵巢結(jié)構(gòu)受到嚴重打擊。較凍存對照組，S1P干預組卵巢結(jié)構(gòu)較完好，部分卵泡發(fā)育為有腔卵泡，原始卵泡及初級卵泡數(shù)目相對較多。在形態(tài)上，卵巢得到較好的保護。原始卵泡是整個生殖壽命中發(fā)育卵泡和卵母細胞的來源。研究表明，絕大多數(shù)原始卵泡會在卵巢組織凍存和移植過程中丟失[19]，而最終決定移植卵巢壽命的是移植卵巢組織中存活下來的原始卵泡的數(shù)量[20]。形態(tài)學研究結(jié)果提示，S1P的干預較單純的玻璃化凍存組能夠保留盡可能多的原始卵泡。

為了探究這種保留較多的原始卵泡的機制是否與S1P的抗凋亡相關，本研究觀察了TUNEL熒光結(jié)果，發(fā)現(xiàn)移植2 d后，S1P干預組顆粒細胞凋亡率低于單純玻璃化凍存組，說明添加了S1P后，有效抑制了顆粒細胞的凋亡。移植14 d后TUNEL檢測無法檢測到凋亡細胞，這可能是由于移植后2周死亡卵泡已經(jīng)消失，此現(xiàn)象在以往研究中也有相似報道[21]。移植2 d和14 d后，凍存組凋亡基因Caspase3以及促凋亡基因Bax表達均高于S1P組，而抗凋亡基因Bcl-2表達均低于S1P組，從mRNA水平驗證S1P的干預對卵巢凍融移植后的抗凋亡作用。

綜上所述，小鼠卵巢玻璃化凍存過程中給予2μmol·L-1S1P的干預可提高卵巢移植后的卵泡存活，可能的機制與其抗凋亡作用有關。