人脂肪源性血管外膜細(xì)胞對CD34+造血干/祖細(xì)胞體外支持的實(shí)驗(yàn)研究

周 芮，楊婷婷，張 磊，許 飛，鄭 波

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004；2.寧夏人類干細(xì)胞研究所，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液內(nèi)科，銀川 750004）

造血干細(xì)胞移植是治療多種難治性血液系統(tǒng)疾病的有效手段，造血干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）共輸注成功促進(jìn)體內(nèi)造血重建已有報道[1]。大量研究[2-3]表明，BMSCs不但參與骨髓造血微環(huán)境構(gòu)成，并能在特定條件下分化為造血基質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生具有多種調(diào)節(jié)造血作用的細(xì)胞因子從而改善造血微環(huán)境，促進(jìn)造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞（hematopoietic stem/progenitor cells，HSPCs）增殖分化。然而，BMSCs不易獲取，難以進(jìn)行有效分離純化等問題影響了移植的療效。因此，尋找替代細(xì)胞將是再生醫(yī)學(xué)急需解決的問題。

血管外膜細(xì)胞（pericyte/perivascular cells，PCs）被認(rèn)為是間充質(zhì)干細(xì)胞的前體細(xì)胞，是一種沿著人體組織器官的小血管廣泛分布，且高表達(dá)CD146標(biāo)記的細(xì)胞群[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，PCs與BMSCs不僅在組織再生和分化潛能等方面存在相似性[6]，還能夠在血管發(fā)育和調(diào)節(jié)微循環(huán)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[7-8]，Corselli等[9]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，髓外脂肪組織來源的PCs能夠通過細(xì)胞間接觸激活Notch通路來重構(gòu)異位造血微環(huán)境，從而支持免疫缺陷小鼠HSPCs移植后長期存活。脂肪組織是人體分布最為廣泛的組織器官之一，脂肪來源的細(xì)胞具有自我更新能力強(qiáng)和高增殖率的特點(diǎn)[10]，并且能夠分泌多種支持HSPCs增殖和分化的正性因子[11-12]，如胰島素樣生長因子-1和轉(zhuǎn)化生長因子-β1等，是相關(guān)造血細(xì)胞的理想來源。但人脂肪源性血管外膜細(xì)胞（human adipose-derived pericyte/perivascular cells，hAD-PCs）是否能夠體外支持UCB CD34+HSPCs生長國內(nèi)尚未見報道，本文通過直接接觸共培養(yǎng)，探究hAD-PCs對UCB CD34+HSPCs在維持體外生長、造血細(xì)胞表面抗原表達(dá)及集落形成等方面的潛能，評估hADPCs對UCB CD34+HSPCs的體外支持效力。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

大網(wǎng)膜脂肪標(biāo)本來源于減重患者胃切除手術(shù)術(shù)中切除大網(wǎng)膜脂肪組織（n=5），臍血標(biāo)本來源于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院產(chǎn)科剖宮產(chǎn)手術(shù)足月新生兒（n=10），患者及家屬簽署知情同意書并獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞購自中國賽業(yè)生物。

淋巴細(xì)胞分離液購自美國GE公司；胎牛血清購自Biological Industries公司；高糖型DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；紅細(xì)胞裂解液購自eBioscience公司；絲裂霉素購自Sigma公司；小鼠抗人CD45-APC-H7抗體、小鼠抗人CD34-APC抗體、小鼠抗人CD33-FITC抗體、小鼠抗人CD19-BV 621抗體、小鼠抗人CD10-PE抗體、小鼠抗人CD14-Alexa 700抗體均購自美國BD公司；MACS分選柱購自德國Miltenyi Biotec公司；各規(guī)格培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板購自Corning美國公司；各規(guī)格離心管購自Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同體系基質(zhì)細(xì)胞與UCB CD34+HSPCs直接接觸共培養(yǎng) 通過酶解和多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分選獲得hAD-PCs，詳見課題組前期建立的分離方法[13]。臍血通過密度梯度離心獲取單個核細(xì)胞，利用免疫磁珠分選得到UCB CD34+HSPCs。實(shí)驗(yàn)組（hAD-PCs組）以hAD-PCs為基質(zhì)細(xì)胞與UCB CD34+HSPCs共培養(yǎng)，陽性對照組（BMSCs組）以BMSCs為基質(zhì)細(xì)胞與UCB CD34+HSPCs共培養(yǎng)，空白組（無基質(zhì)細(xì)胞組）以UCB CD34+HSPCs單獨(dú)培養(yǎng)?；|(zhì)細(xì)胞以1.5×104/孔細(xì)胞密度種植于96孔板，每組設(shè)5個復(fù)孔，待24 h基質(zhì)細(xì)胞貼壁達(dá)80%用4μg·mL-1濃度的絲裂霉素處理2 h。絲裂霉素處理后24 h將UCB CD34+HSPCs以4×104/孔的密度分別加至預(yù)先處理hAD-PCs、BMSCs基質(zhì)層上。

1.2.2 共培養(yǎng)后UCB CD34+HSPCs增殖情況 在共培養(yǎng)的1、2、4周時，倒置顯微鏡下觀察hADPCs組、BMSCs組及無基質(zhì)細(xì)胞組細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞密度的改變。在各時間點(diǎn)收集懸浮的UCB CD34+HSPCs，清洗后細(xì)胞加入Tryple消化收集剩余UCB CD34+HSPCs，用臺盼藍(lán)拒染法進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.2.3 共培養(yǎng)后流式分析UCB CD34+HSPCs造血標(biāo)記表達(dá)情況 在共培養(yǎng)的1、2、4周時，收集懸浮的UCB CD34+HSPCs，離心重懸后以每毫升體積細(xì)胞懸液與鼠血清體積比為20∶1進(jìn)行30 min低溫封閉。封閉后將細(xì)胞分為樣本管、同型管及空白管加入相應(yīng)的抗體：將總體積60%的細(xì)胞設(shè)為樣本管，加入各抗體（小鼠抗人CD45-APCH7抗體、小鼠抗人CD33-FITC抗體、小鼠抗人CD34-APC抗體、小鼠抗人CD10-PE抗體、小鼠抗人CD19-BV 621抗體及小鼠抗人CD14-Alexa 700抗體）1μL；總體積20%的細(xì)胞設(shè)為同型管，分別加入1μL小鼠抗人CD45-APC-H7、小鼠抗人CD33-FITC、小鼠抗人CD34-APC、小鼠抗人CD10-PE、小鼠抗人CD19-BV 621及小鼠抗人CD14-Alexa 700的相應(yīng)抗體；空白管封閉后不加入任何抗體。樣本管及同型管加入抗體冰上孵育30 min，重懸后離心清洗殘余抗體后重懸至300μL上機(jī)檢測。因無基質(zhì)細(xì)胞組細(xì)胞數(shù)持續(xù)減少，故不納入流式檢測。

1.2.4 共培養(yǎng)后UCB CD34+HSPCs集落形成情況分析 在共培養(yǎng)的1、2、4周時，收集懸浮的UCB CD34+HSPCs，用臺盼藍(lán)拒染法進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。以1×103個/mL的細(xì)胞數(shù)將細(xì)胞吹打混勻于甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中，將1 mL培養(yǎng)基接種于35 mm×10 mm的培養(yǎng)皿放置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，各培養(yǎng)體系設(shè)置3皿。培養(yǎng)2周后倒置顯微鏡下觀察集落形態(tài)，大于200個細(xì)胞的細(xì)胞簇視為一個集落進(jìn)行計數(shù)。因無基質(zhì)細(xì)胞組細(xì)胞數(shù)持續(xù)減少，故不納入集落統(tǒng)計。

1.2.5 共培養(yǎng)后上清液細(xì)胞因子表達(dá)水平變化 在共培養(yǎng)體系建立的1、2、4周，將UCB CD34+HSPCs自96孔板中吸出，離心后將細(xì)胞上清液留置于1.5 mL無菌EP管中。標(biāo)注培養(yǎng)體系、培養(yǎng)時間等信息保存至-80℃冰箱，ELISA法檢測IL-3、IL-6、TPO、SCF等細(xì)胞因子表達(dá)水平，因1例數(shù)據(jù)缺失故取4例共培養(yǎng)的上清液進(jìn)行細(xì)胞因子表達(dá)水平統(tǒng)計。因無基質(zhì)細(xì)胞組細(xì)胞數(shù)持續(xù)減少，故不納入因子分泌檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x±Sx）表示。造血標(biāo)記表達(dá)指標(biāo)、集落單位形成數(shù)量和細(xì)胞因子表達(dá)水平的組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，細(xì)胞數(shù)量三組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)體系共培養(yǎng)后UCB CD34+HSPCs形態(tài)變化

倒置顯微鏡下觀察結(jié)果顯示：接種時（0周），hAD-PCs組、BMSCs組及無基質(zhì)細(xì)胞組鏡下觀察上層細(xì)胞UCB CD34+HSPCs折光性良好，分界清晰（圖1A～C），hAD-PCs組及BMSCs組鏡下可見梭形生長的基質(zhì)細(xì)胞存在（圖1A、B）。培養(yǎng)至1周鏡下可見hAD-PCs組及BMSCs組細(xì)胞密度增長，細(xì)胞仍透亮橢圓（圖1D、E），而無基質(zhì)細(xì)胞組細(xì)胞密度明顯降低，形態(tài)改變折光性差（圖1F）。共培養(yǎng)至2周時，hAD-PCs組及BMSCs組UCB CD34+HSPCs細(xì)胞數(shù)量明顯增長，聚集生長，鏡下可見細(xì)胞透亮（圖1G、H），無基質(zhì)細(xì)胞組細(xì)胞形態(tài)改變，胞質(zhì)渾濁，鏡下可見密度降低（圖1I）。hAD-PCs組及BMSCs組細(xì)胞培養(yǎng)至4周時UCB CD34+HSPCs數(shù)量降低，細(xì)胞仍維持較好的形態(tài)（圖1J、K），無基質(zhì)細(xì)胞組細(xì)胞全部死亡皺縮，喪失細(xì)胞正常形態(tài)（圖1L），與hADPCs組及BMSCs組細(xì)胞相比差異明顯。

圖1 UCB CD34+HSPCs不同培養(yǎng)體系細(xì)胞及不同培養(yǎng)時間的鏡下表現(xiàn)（×100）

2.2 不同培養(yǎng)體系共培養(yǎng)后UCB CD34+HSPCs細(xì)胞數(shù)量分析

共培養(yǎng)接種當(dāng)天（0周）各培養(yǎng)體系UCB CD34+HSPCs初始數(shù)量均為4×104個細(xì)胞。培養(yǎng)至1周時，hAD-PCs組及BMSCs組的UCB CD34+HSPCs細(xì)胞數(shù)少量增長，分別增長至（4.83±1.64）×104個細(xì)胞和（4.49±1.60）×104個細(xì)胞，無基質(zhì)細(xì)胞組細(xì)胞大量死亡，細(xì)胞數(shù)為（1.47±0.27）×104個細(xì)胞，各組UCB CD34+HSPCs數(shù)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。共培養(yǎng)至第2周，hAD-PCs組及BMSCs組UCB CD34+HSPCs細(xì)胞數(shù)量達(dá)到高峰，分別為（5.93±1.45）×104和（5.91±0.79）×104個細(xì)胞，無基質(zhì)細(xì)胞組細(xì)胞數(shù)減少至（0.35±0.10）×104個細(xì)胞，hAD-PCs組、BMSCs組共培養(yǎng)后的UCB CD34+HSPCs細(xì)胞數(shù)量均高于無基質(zhì)細(xì)胞組（P均＜0.05，n=5）。UCB CD34+HSPCs培養(yǎng)4周時，hAD-PCs組及BMSCs組UCB CD34+HSPCs數(shù)下降至（4.88±0.97）×104和（3.35±0.63）×104，無基質(zhì)細(xì)胞組無細(xì)胞存活。hAD-PCs組及BMSCs組各時間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05，n=5）。因第5周細(xì)胞全部死亡，故未行統(tǒng)計學(xué)分析（圖2）。

圖2 UCB CD34+HSPCs不同培養(yǎng)體系細(xì)胞數(shù)變化（n=5）

2.3 不同培養(yǎng)體系共培養(yǎng)后UCB CD34+HSPCs造血標(biāo)記表達(dá)情況

經(jīng)多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測BMSCs組和hADPCs組的UCB CD34+HSPCs在1周、2周及4周的全血細(xì)胞表達(dá)CD45+標(biāo)記、造血祖細(xì)胞表達(dá)CD34+CD33-標(biāo)記、淋巴細(xì)胞表達(dá)CD10+/CD19+標(biāo)記和髓系細(xì)胞表達(dá)CD14+標(biāo)記（圖3A），經(jīng)統(tǒng)計兩組細(xì)胞以上表面標(biāo)記表達(dá)在各時間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05，n=5）（圖3B）。

圖3 UCB CD34+HSPCs造血標(biāo)記表達(dá)情況分析圖

2.4 共培養(yǎng)后UCB CD34+HSPCs集落形成情況分析

共培養(yǎng)1周、2周、4周的UCB CD34+HSPCs細(xì)胞種植于甲基纖維素半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d均有集落單位形成（圖4A），結(jié)果顯示，在1周、2周和4周UCB CD34+HSPCs形成的集落單位數(shù)量兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05，n=5）（圖4B）。

圖4 UCB CD34+HSPCs集落形成情況分析圖（n=5）

2.5 共培養(yǎng)后上清液細(xì)胞因子表達(dá)水平分析

采用ELISA法檢測BMSCs組和hAD-PCs組共培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子分泌水平結(jié)果顯示，hAD-PCs組的SCF在1周時和G-CSF在2周時表達(dá)量高于BMSCs組（P=0.008；P=0.002，n=4）；hAD-PCs組的IL-2在2周時，VEGF、G-CSF和SCF在4周時表達(dá)量低于BMSCs組（P=0.01；P=0.04；P=0.02；P=0.004，n=4）；IL-3、IL-6、TPO、IFN-γ及TNF-α表達(dá)水平兩組各時間點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05，n=4）（圖5）。

圖5 不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子表達(dá)水平統(tǒng)計圖（n=4）

3 討論

細(xì)胞治療在血液惡性疾病治療方面已取得了很好的療效，其中HSPCs移植已成為治療多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤的理想方式[14-16]。BMSCs所組成的骨髓造血微環(huán)境是HSPCs賴以生存的基本功能單位，BMSCs分泌的細(xì)胞因子及造血細(xì)胞本身均參與造血穩(wěn)態(tài)的調(diào)控[2]。研究顯示，BMSCs在良好培養(yǎng)條件下可通過細(xì)胞接觸和分泌可溶性因子模擬造血微環(huán)境，從而對HSPCs起到體外支持的作用[17-18]。因此，BMSCs被認(rèn)為是目前促進(jìn)造血基質(zhì)細(xì)胞理想來源。但是在人體骨髓中105～106個單個核細(xì)胞中才能獲得1個BMSCs[19]，并且因其缺乏特殊的表面標(biāo)記難以有效分離純化，且經(jīng)過體外培養(yǎng)得到的BMSCs常為混合細(xì)胞群，種種問題限制了其應(yīng)用。為滿足臨床治療疾病的需要，分離純化和擴(kuò)增出大量的造血基質(zhì)細(xì)胞變得尤為重要。

PCs作為間充質(zhì)干細(xì)胞的前體細(xì)胞，可在人體多種組織器官的周圍微血管和毛細(xì)血管被發(fā)現(xiàn)[5，9]。研究發(fā)現(xiàn)，髓外脂肪來源的PCs表達(dá)趨化因子-12和Notch通路關(guān)鍵配體Jagged-1，移植后可通過細(xì)胞間接觸和活化Notch信號來維持免疫缺陷小鼠的長期存活[9，20]。Pierantozzi等[21]已證明hAD-PCs與同來源間充質(zhì)干細(xì)胞相比具有更好的分化能力。以上研究結(jié)果提示了hAD-PCs在造血方面應(yīng)用具有廣闊的前景，hAD-PCs對于HSPCs是否具有與BMSCs相似的支持作用值得探討。大量研究表明BMSCs通過細(xì)胞接觸和分泌細(xì)胞因子在造血過程中起著關(guān)鍵作用[22-24]，本研究在未額外添加TPO、SCF等造血促進(jìn)因子的情況下，將hAD-PCs與UCB CD34+HSPCs直接接觸共培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)后UCB CD34+HSPCs細(xì)胞數(shù)量、造血細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)和集落形成能力等指標(biāo)評估hAD-PCs作為基質(zhì)細(xì)胞對UCB CD34+HSPCs的體外支持效能。

本研究通過檢測hAD-PCs和BMSCs作為基質(zhì)細(xì)胞分泌的造血相關(guān)細(xì)胞因子來比較它們的分泌功能，結(jié)果表明hAD-PCs所分泌的部分細(xì)胞因子與BMSCs分泌水平存在異同。hAD-PCs組與BMSCs組IL-3、IL-6、TPO、IFN-γ及TNFα表達(dá)水平在培養(yǎng)的各時間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。IL-3又被稱為多能集落刺激因子，在造血中期促進(jìn)多能祖細(xì)胞向定向祖細(xì)胞分化；IL-6則通過抑制樹突狀細(xì)胞的分化參與MSCs的免疫調(diào)節(jié)[25]，TPO在晚期造血中誘導(dǎo)巨核細(xì)胞形成成熟血小板的因子，另外，IFN-γ和TNF-α作為負(fù)性造血因子能夠與其他因子協(xié)同使其停留在細(xì)胞周期的靜止期，阻斷原始細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期從而抑制造血[26]。hAD-PCs在促進(jìn)HSPCs增殖分化及動員的細(xì)胞因子SCF（1周）和G-CSF（2周）在培養(yǎng)早期分泌量高于BMSCs，IL-2在培養(yǎng)第2周，VEGF、G-CSF和SCF在培養(yǎng)第4周的分泌水平低于BMSCs。研究顯示，GM-CSF、SCF、TPO和IL-3等細(xì)胞因子可通過快速增加靜止期細(xì)胞中的活性氧水平從而促進(jìn)小鼠和人HSPCs的增殖[27]；G-CSF還可刺激體外培養(yǎng)的造血前體細(xì)胞形成定向分化的細(xì)胞群[28]，白細(xì)胞介素家族因子可直接作用于淋巴細(xì)胞和促進(jìn)造血前體細(xì)胞分化成熟[25]。但以上細(xì)胞因子表達(dá)水平的差異宏觀表現(xiàn)在促進(jìn)UCB CD34+HSPCs體外生長、形成集落單位能力和血細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)方面無統(tǒng)計學(xué)意義，表明多數(shù)細(xì)胞因子需要與其他細(xì)胞因子協(xié)同共同調(diào)節(jié)造血功能。其中，UCB CD34+HSPCs增殖結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，hAD-PCs作為基質(zhì)層培養(yǎng)的UCB CD34+HSPCs細(xì)胞數(shù)量逐漸增高，在第2周達(dá)到高峰后開始下降，細(xì)胞增殖趨勢與BMSCs組細(xì)胞相同；無基質(zhì)層滋養(yǎng)UCB CD34+HSPCs在培養(yǎng)全程細(xì)胞數(shù)持續(xù)下降，第4周全部死亡。結(jié)果表明hAD-PCs作為基質(zhì)層在培養(yǎng)過程中能夠?qū)CB CD34+HSPCs具有體外支持的能力，進(jìn)一步證實(shí)了Corselli等[9]提出的PCs具有體外維持HSPCs再生能力和自我更新潛能的結(jié)論。半固體細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)集落形成單位的數(shù)量作為評價造血細(xì)胞增殖分化能力的重要指標(biāo)，hAD-PCs滋養(yǎng)的UCB CD34+HSPCs在各時間點(diǎn)表達(dá)的全血細(xì)胞標(biāo)記CD45+、造血祖細(xì)胞標(biāo)記CD34+CD33-、淋巴細(xì)胞標(biāo)記CD10+/CD19+和髓系細(xì)胞標(biāo)記CD14+表達(dá)與BMSCs組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，并且以hAD-PCs為基質(zhì)層和以BMSCs為基質(zhì)層所培養(yǎng)的UCB CD34+HSPCs經(jīng)體外培養(yǎng)均能形成集落形成單位，經(jīng)統(tǒng)計分析集落數(shù)量各時間點(diǎn)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，hAD-PCs作為基質(zhì)細(xì)胞與經(jīng)典BMSCs相似，具有體外支持UCB CD34+HSPCs的潛能。本課題組后續(xù)將進(jìn)一步探究hAD-PCs與BMSCs調(diào)控機(jī)制的異同，對于其臨床轉(zhuǎn)化作為BMSCs再生醫(yī)學(xué)治療的替代細(xì)胞提供理論依據(jù)。