NOD2-/-小鼠H37Ra感染后對肺組織Toll樣受體表達的影響

劉俊彤，湯業(yè)珍，彭 茜，韓懷欽，梁錦屏，2

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院臨床病原生物重點實驗室，銀川 750004）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一種慢性傳染病，估算全球約有17億人感染結(jié)核分枝桿菌，我國每年新發(fā)病例約為130萬，居全球第二位[1]。結(jié)核病耐藥菌株的高發(fā)病率[2]以及MTB與HIV共感染是目前面對的棘手問題[3]。因此，需要尋求新型有效的抗MTB治療方法。結(jié)核分枝桿菌感染機體后，機體能夠通過各種模式識別受體識別結(jié)核分枝桿菌組分，從而發(fā)揮抗感染免疫作用[4]。其中Toll樣受體（toll like receptor，TLR）2、TLR4和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2（nucleotide-binding oligomerization domain 2，NOD2）分別是細胞膜上和細胞內(nèi)的模式識別受體，在感染中發(fā)揮重要作用[5-7]。

機體的免疫調(diào)控是復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，各信號通路之間往往存在相互作用與聯(lián)系[8]。NOD2主要表達于單核細胞和巨噬細胞，除了產(chǎn)生炎性細胞因子，還能夠通過NF-κB和MAPK途徑增加趨化因子的產(chǎn)生，從而使免疫細胞在機體抗感染中發(fā)揮重要作用[9]。當(dāng)微生物突破機體的皮膚、黏膜等物理屏障時，Toll樣受體可識別病原體并刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在菌體的刺激下，不同的TLRs將信號傳遞給下游分子，從而激活多種信號通路，其中之一就是通過激活NF-κB進而表達炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α等[10]。研究發(fā)現(xiàn)，除了TLR3外，其余TLRs是通過活化髓樣分化因子88（MyD88）激活下游NF-κB和MAPK途徑，而NOD1、NOD2是通過募集活化RIP2蛋白激活NF-κB[9]，因此NOD2和TLRs在激活下游NF-κB途徑可能存在相互作用。目前研究中對肺組織NOD2與TLRs信號通路在結(jié)核分枝桿菌感染時存在怎樣的調(diào)控關(guān)系仍不清楚[11]。本文旨在探討NOD2-/-小鼠感染結(jié)核分枝桿菌H37Ra后Toll樣受體TLR2、TLR4的變化，為豐富結(jié)核分枝桿菌致病機理及尋求臨床免疫治療或設(shè)計新型疫苗提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物NOD2-/-小鼠由美國國家醫(yī)學(xué)院院士耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系Richard A.Flavell教授饋贈于寧夏醫(yī)科大學(xué)梁錦屏副教授，寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心SPF條件下飼養(yǎng)繁殖，設(shè)立野生型小鼠C57BL/6為對照（WT）組。小鼠6～8周齡雄鼠，18～22 g，每只小鼠均剪取指甲提取DNA采用瓊脂糖凝膠電泳重復(fù)鑒定，確認無誤后隨機分組。分籠前飼養(yǎng)3 d，自由攝取食水。

1.1.2 試劑TLR2、TLR4等兔抗鼠抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；ECL（Enhanced chemiluminescent）化學(xué)發(fā)光液（Amersham，美國）；RNA提取試劑盒（天根生化科技公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）；ELISA試劑盒（酶聯(lián)生物科技有限公司）；PCR引物由上海生工設(shè)計合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及模型構(gòu)建NOD2敲除組和野生型組隨機分為生理鹽水組和H37Ra組，即生理鹽水滴注野生型小鼠組（wn）、H37Ra滴注野生型小鼠組（wh）、生理鹽水滴注NOD2-/-小鼠組（nn）、H37Ra滴注NOD2-/-小鼠組（nh），共4組，每組6只。腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，采用非暴露式氣管滴注30μL H37Ra菌液（1×106CFU），垂直懸掛1 min使菌液在肺臟內(nèi)均勻分布，建立感染模型小鼠，陰性對照組（wn、nn組）同法滴注30μL生理鹽水。造模1周后各組處死6只小鼠取材，8周后取各組剩余小鼠組織。

1.2.2 觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變 實驗結(jié)束后，無菌取肺臟，4%的多聚甲醛固定48 h，進行脫水、包埋、切片并HE和抗酸染色。鏡檢觀察小鼠感染情況及肺臟病變程度。

1.2.3 肺組織中TLR2、TLR4基因表達情況 取小鼠肺組織，無菌無酶環(huán)境下提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，按照qPCR試劑盒說明書進行PCR反應(yīng)，實驗所用引物見表1。

表1 PCR實驗所用引物

1.2.4 Western blot檢測細胞中TLR2、TLR4蛋白的表達 取小鼠肺組織，提總蛋白，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37℃，搖床孵育2 h。特異性抗體孵育（一抗稀釋比為1∶1000），4℃水平搖床過夜。次日1∶7000稀釋山羊抗兔二抗室溫孵育2 h，ECL底物顯色，蛋白成像系統(tǒng)曝光檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOD2-/-小鼠、野生型小鼠基因型鑒定

結(jié)果表明，1、2號小鼠為NOD2-/-小鼠；3、4號小鼠為野生型小鼠。見圖1。

圖1 PCR瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因型

2.2 結(jié)核分枝桿菌H37Ra感染對NOD2-/-小鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響

1周WT小鼠感染后肺組織中可見炎性細胞浸潤、多數(shù)肺泡腔消失，NOD2-/-小鼠感染組可見肺組織中有彌漫性炎性細胞浸潤，肺組織實變，多數(shù)肺泡腔消失，高倍鏡下可見上皮樣細胞、單核細胞和淋巴細胞為主的肉芽腫樣病變。8周各組與1周組病理特征相似，無明顯差異。見圖2。

圖2 小鼠肺組織病理切片HE染色（×200）

2.3 觀察結(jié)核分枝桿菌H37Ra感染NOD2-/-小鼠后肺組織中結(jié)核分枝桿菌菌體

1周小鼠抗酸染色后，NOD2-/-與WT感染組見較少的結(jié)核病變結(jié)節(jié)，生理鹽水組未出現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌菌體；8周NOD2-/-小鼠感染組肺組織內(nèi)出現(xiàn)MTB聚集成團，NOD2-/-小鼠感染MTB后其炎癥病理較WT小鼠感染組更嚴重。見圖3。

圖3 小鼠肺臟抗酸染色結(jié)果（×1000）

2.4 NOD2-/-小鼠感染結(jié)核分枝桿菌H37Ra后對TLR2、TLR4基因表達的影響

NOD2-/-小鼠與WT小鼠經(jīng)氣管滴入生理鹽水、H37Ra，提取肺組織RNA，利用RT-qPCR技術(shù)檢測兩組TLR2、TLR4基因的表達。8周NOD2-/-小鼠H37Ra感染組TLR2、TLR4表達均高于WT小鼠H37Ra感染組（P均<0.001）。1周與8周WT小鼠組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），8周NOD2-/-小鼠感染組TLR2、TLR4 mRNA均高于1周NOD2-/-小鼠感染組（P均<0.001）。見圖4。

圖4 NOD2-/-與WT小鼠肺組織中TLR2、TLR4基因表達

2.5 結(jié)核分枝桿菌H37Ra感染NOD2-/-小鼠后肺組織中TLR2、TLR4蛋白表達量

經(jīng)Western blot對兩組小鼠肺組織中TLR2、TLR4蛋白表達情況進行測定。結(jié)果顯示，1周組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），8周NOD2-/-小鼠感染組TLR4、TLR2蛋白表達量比WT小鼠感染組升高（P<0.05），相比于NOD2-/-小鼠生理鹽水組，H37Ra感染組TLR2和TLR4蛋白活化增加（P<0.01）。8周WT小鼠H37Ra感染組高于WT小鼠生理鹽水組（P<0.01）。見圖5。

3 討論

TB的防治是一項長期而艱巨的工作，寧夏地區(qū)作為偏遠地區(qū)甚至有增加的趨勢[12]?？菇Y(jié)核藥物不但有藥物毒副作用，而且有耐藥甚至耐多藥的MTB產(chǎn)生，近年來出現(xiàn)結(jié)核病和艾滋病的雙重感染也是結(jié)核病防治的難題，因此目前迫切需要尋找更多抗結(jié)核的方法[13]。

H37Ra菌株比H37Rv菌株毒力弱，相比卡介苗（BCG）更接近結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的結(jié)構(gòu)，免疫原性更高，作為動物感染模型菌株更合適，能為設(shè)計新型疫苗提供基礎(chǔ)研究[14-15]。TLR2/4可通過MyD88依賴途徑，激活MyD88及相應(yīng)的下游效應(yīng)因子來磷酸化NF-κB的抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB），從而活化NF-κB，啟動相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮免疫作用。有研究發(fā)現(xiàn)，NOD2缺陷的小鼠控制結(jié)核分枝桿菌的能力大大下降[16]，這說明NOD2可能在天然抗結(jié)核免疫中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。NOD2與配體結(jié)合后，誘發(fā)一系列炎性因子的產(chǎn)生，從而起到抗感染免疫作用。研究表明，NF-κB可能是NOD受體和TLR在天然免疫中起協(xié)同作用的信號通路基礎(chǔ)[17]。雖然已清楚NOD2和TLR2活化后可激活NF-κB和AP-1信號通路，但是這兩個信號通路之間是否能相互影響，在抗感染時是否對彼此有調(diào)控作用還不清楚[18]。在課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，TLRs的下游信號因子MyD88缺失時，BCG感染小鼠的NOD2受體可補充發(fā)揮免疫作用[19]。

圖5 NOD2-/-與WT小鼠不同處理后肺組織TLR2、TLR4蛋白表達

本實驗利用NOD2-/-小鼠模型，觀察在NOD2缺失的情況下TLR的表達，探討NOD樣受體（NOD-like receptor，NLR）和TLR相互調(diào)控，共同抗菌的機制。抗酸結(jié)果顯示，H37Ra感染小鼠1周后出現(xiàn)少量結(jié)核分枝桿菌菌體，而對照組未出現(xiàn)，8周差異更顯著，且NOD2缺陷小鼠感染組相對于野生小鼠組結(jié)核分枝桿菌菌體普遍增多，H37Ra可以有效感染小鼠。病理結(jié)果表明，1周和8周兩種小鼠感染組肺紋理增粗，間質(zhì)少量充血，炎性細胞浸潤增多，但肺組織未見典型的干酪樣結(jié)核性壞死。這與張愛霞等[20]和夏長勝[21]的研究結(jié)果不一致，認為感染7 d后小鼠肺臟組織紋理清晰，間質(zhì)正常，未見明顯炎癥性損傷，分析是由于造模方式不同，上述研究采用尾靜脈注射；而Lai等[22]認為在肺部感染減毒結(jié)核分枝桿菌（MTB H37Ra）的早期階段，肺部感染水平以對數(shù)方式增加，直至C57BL/6小鼠感染后第14天和第21天，這與本實驗H37Ra感染小鼠8周抗酸結(jié)果一致。提取小鼠肺組織的RNA與蛋白，檢測TLR2和TLR4的表達，更準確地體現(xiàn)H37Ra感染的NOD2-/-小鼠肺組織中TLR2、TLR4蛋白的作用。本研究發(fā)現(xiàn)H37Ra感染小鼠1周TLR2和TLR4蛋白的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這與基因檢測結(jié)果一致。處理8周WT小鼠相比于NS組，H37Ra感染組TLR2和TLR4的表達上升，這與Li等[23]的研究結(jié)果一致；NOD2-/-小鼠感染H37Ra后TLR2、TLR4蛋白表達較野生型小鼠升高。本研究結(jié)果表明，NOD2基因缺失時，H37Ra感染后的小鼠TLR2、TLR4基因表達升高，補充發(fā)揮抗感染免疫作用。有研究發(fā)現(xiàn)，雖然NOD2激活NFκB通路，但它抑制TLRs介導(dǎo)的NF-κB激活，因此NOD2缺失降低了這種抑制作用，使NF-κB增加[24]，而Wu等[25-26]認為一些炎癥因子或者NF-κB的表達與TLR2/TLR4之間存在正反饋調(diào)節(jié)，因此本課題組將繼續(xù)進行后續(xù)通路的研究。

在其他疾病的研究中，已經(jīng)對這兩個信號的關(guān)系有一些定論。Khan等[9]研究表明NOD2和TLR4在激活樹突狀細胞（DC）活性方面表現(xiàn)出協(xié)同作用。因此，同時激活NOD2和TLR4可能具有顯著的免疫治療潛力，可增強DC的功能，提高對病原體的免疫力。Khan等[27]認為NOD-2L和TLR-4L與減少劑量的異煙肼相結(jié)合，降低了肺部的MTB，這種模式識別受體和TB藥物的輔助治療可能具有足夠的潛力來減少結(jié)核病患者的治療劑量和持續(xù)時間，并且為結(jié)核病治療開辟了新的途徑，包括免疫療法。而NOD2與TLR4的協(xié)同作用導(dǎo)致與疾病相關(guān)的大腦核團活化增加，從而加強疾病和大腦對外周免疫刺激的反應(yīng)，NLR和TLR在免疫細胞水平上的已知相互作用延伸到影響大腦功能和行為的相互作用[28]。最新數(shù)據(jù)表明NOD2基因沉默在軟骨細胞中29 kDa氨基端纖維連接蛋白片段（29 kDa Fn-f）與TLR2表達下降，顯示NOD2參與29 kDa Fn-f誘導(dǎo)的TLR2表達[29]。但是關(guān)于TLR4、TLR2和NOD2在結(jié)核病中的抗菌機制還不完善，因此本研究具有創(chuàng)新性和必要性，課題組后續(xù)將繼續(xù)采用NOD2與TLR4激動劑處理小鼠和相關(guān)免疫細胞進行研究。