基于Sestrin 2通過mTOR信號通路調(diào)節(jié)胰腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的實驗研究

戴勝杰，陳豪，樓彬，孫洪偉

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽胰外科，浙江 溫州 325035；2.浙江省杭州市余杭區(qū)第三人民醫(yī)院 普外科，浙江 杭州 311115）

胰腺癌由于其進展迅速、早篩率較低等因素，被認(rèn)為是惡性程度極高的腫瘤，其5 年生存率不到5%[1-3]。目前胰腺癌的治療仍以手術(shù)治療為主，而只有不到10%的胰腺癌患者能達(dá)到根治性切除的標(biāo)準(zhǔn)，且仍不能保證術(shù)后生存期[2-4]。雖然近年來靶向治療、放療、化療、生物治療等輔助治療技術(shù)取得較大進步，在一定程度上改善了胰腺癌的預(yù)后，但這種改善仍不盡人意。因此，尋找有效遏制胰腺癌惡化進程的手段變得極為重要。

眾所周知，當(dāng)腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移時，治療變得更加困難。而上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進程被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移侵襲的早期階段，隨著EMT進程的推進，細(xì)胞骨架發(fā)生重塑，細(xì)胞的黏附力減弱甚至喪失，細(xì)胞極性異常，從而增加轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移擴散。在EMT進程中，上皮細(xì)胞特征標(biāo)志物表達(dá)減少（如E-鈣黏蛋白，被認(rèn)為是腫瘤向浸潤性癌進展的關(guān)鍵步驟），而間質(zhì)細(xì)胞特征標(biāo)志物表達(dá)相應(yīng)增加（如N-鈣黏蛋白、波形蛋白）[5-6]。Sestrins家族成員主要有Sestrin 1、Sestrin 2和Sestrin 3[7-8]。Sestrin 2（SESN2）主要在細(xì)胞增殖分化、凋亡自噬和生長存活中發(fā)揮作用，并參與調(diào)控mTOR信號通路。Sestrin 2 可通過激活A(yù)MP依賴性蛋白激酶（AMPK）和失活Rheb胍三磷酸酶來抑制mTORC1，也可直接抑制RAG GTP酶來影響mTORC1活性，從而調(diào)控細(xì)胞的生長和分化。同時，mTOR參與了EMT進程中具有不容忽視的作用[9]。已有研究表明，Sestrin 2在結(jié)直腸癌、肺癌、黑色素瘤等多種腫瘤中的表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致mTOR信號通路過度激活，導(dǎo)致細(xì)胞代謝和氧化應(yīng)激失衡，從而促進腫瘤的增殖、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[10-13]。而Sestrin 2 在胰腺癌惡化進程中的作用尚不清楚。因此，本研究將探索Sestrin 2 在胰腺癌EMT進程中的作用，并探究其是否與mTOR信號通路具有相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和試劑

本研究采用兩種人胰腺癌細(xì)胞系進行研究，分別為PANC-1 細(xì)胞系和CFPAC-1 細(xì)胞系（購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫）。上述胰腺癌細(xì)胞采用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)法，相應(yīng)培養(yǎng)基分別為添加了10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基?？筍estrin 2抗體購自Proteintech（美國）?？笶-鈣黏蛋白抗體、抗N-鈣黏蛋白抗體、抗波形蛋白抗體和抗p70S6K抗體均購自Sigma Chemical（美國）。

1.2 病毒轉(zhuǎn)染和分組方法

上述兩種胰腺癌細(xì)胞株分別進行Sestrin 2 敲減病毒、Sestrin 2 陰性敲減病毒、Sestrin 2 過表達(dá)病毒和Sestrin 2 陰性過表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染，最終將每種胰腺癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染培養(yǎng)形成對照組、Sestrin 2 敲減組（Sestrin 2-組）、Sestrin 2過表達(dá)組（Sestrin 2+組）、陰性敲減組和陰性過表達(dá)組五個模型。

1.3 劃痕實驗

將不同模型組細(xì)胞接種于6孔板上，每孔約2× 105個細(xì)胞。當(dāng)6孔板中細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%～100%時，將其原有培養(yǎng)基去除，采用無血清培養(yǎng)基孵育1 h，然后用無菌移液管尖均勻用力劃出一道劃痕，并將 0 h和48 h后的劃痕情況進行拍攝并定量計算，統(tǒng)計實驗結(jié)果。

1.4 Transwell侵襲實驗

首先，將基質(zhì)膠（BD Biosciences，CA，USA）均勻鋪于Transwell板小室底部的聚對苯二甲酸乙二酯膜（8 μm孔徑）上，待其凝固成膠凍狀后將已經(jīng)過饑餓處理后的胰腺癌細(xì)胞（含有約5×104個細(xì)胞的100 μL無血清培養(yǎng)液）接種至小室中，同時在下室加入500 μL含10%胎牛血清的對應(yīng)培養(yǎng)基。胎牛血清鋪墊在下室中可作為趨化因子促進腫瘤細(xì)胞的侵襲行為。經(jīng)過恒溫箱24 h的孵育，取出小室置入 4%多聚甲醛中固定15 min，隨后用結(jié)晶紫試劑染色10 min后沖洗干凈，并擦去小室內(nèi)膜細(xì)胞。最后，將小室倒置，隨機選取3個視野對小室進行觀察，計數(shù)外膜細(xì)胞數(shù)并攝像。

1.5 Western blotting實驗

將含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液加至培養(yǎng)后的相應(yīng)模型胰腺癌細(xì)胞中使細(xì)胞裂解而收集總裂解產(chǎn)物。然后離心總裂解產(chǎn)物，收集離心后上清液，并用BCA法測定蛋白濃度后在10%聚丙烯酰胺凝膠中分離相應(yīng)蛋白質(zhì)混合物（包括預(yù)染色的蛋白質(zhì)標(biāo)志物）。隨后，將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，在室溫下把相應(yīng)PVDF膜放在5%脫脂乳的Tris緩沖鹽水（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含有150 mmol/L NaCl和0.1% Tween-20）中封閉2 h后，最后將PVDF膜置于對應(yīng)一抗溶液中4 ℃孵育過夜。次日，將PVDF膜用TBST 清洗后，放在辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合的二抗中室溫孵育1 h，使用AlphaEaseFC（STandalone）記錄和測量蛋白條帶的密度。

1.6 RNA提取和RT-PCR

使用Trizol試劑（Ambion，Carlsbad，California，USA）提取對應(yīng)胰腺癌細(xì)胞組總RNA。然后，將不同組別的總RNA（1 μg）進行逆轉(zhuǎn)錄，隨后加入SYBR Green Master進行RT-PCR，用7500實時PCR系統(tǒng)進行qRT-PCR定量分析，計算相應(yīng)ΔCt值，并進行分析。β-actin作為內(nèi)參。不同PCR引物具體序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.7 動物負(fù)瘤實驗

將約1×107個胰腺癌細(xì)胞懸浮液注射于無胸腺裸鼠皮下[BALB/C-nu/nu，6～8周齡，雌性，購自中國科學(xué)院動物中心（上海）]。隨著腫瘤細(xì)胞定植在裸鼠皮下，會在注射部位形成微腫瘤，定期觀察各模型組裸鼠的腫瘤情況。相關(guān)動物實驗倫理已經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.8 TCGA數(shù)據(jù)庫分析

在癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（TCGA，https://tcgadata.nci.nih.gov/tcga/）中下載176例胰腺癌患者相關(guān)數(shù)據(jù)并進行分析，相應(yīng)操作均符合TCGA相關(guān)政策。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件（IBM，USA）進行分析，收集3次以上獨立實驗獲得的數(shù)據(jù)，并用（）表示。組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，而P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sestrin 2在人胰腺癌中呈低表達(dá)并與胰腺癌預(yù)后密切相關(guān)

首先，本研究初步探索了Sestrin 2與胰腺癌的關(guān)系。通過分析來自TCGA數(shù)據(jù)庫的176例胰腺癌患者數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Sestrin 2組比低表達(dá)Sestrin 2 組擁有更長的生存周期（P＜0.05，圖1A）。其次，我們簡單分析了Sestrin 2與KRAS之間的相關(guān)性（KRAS作為胰腺癌的四大驅(qū)動基因之一，在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用）。結(jié)果表明，Sestrin 2在存在KRAS突變的胰腺癌患者中的表達(dá)量顯著低于無KRAS突變的胰腺癌患者（P＜0.05，圖1B）。最后，我們對四組人類胰腺癌組織及其癌旁胰腺組織進行蛋白質(zhì)定量檢測，結(jié)果表明Sestrin 2 在胰腺癌組織中呈顯著低表達(dá)（圖1C）。

圖1 Sestrin 2在胰腺癌患者組織中的表達(dá)情況及其與預(yù)后的相關(guān)性

2.2 Sestrin 2與胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲能力密切相關(guān)

上述結(jié)果初步表明Sestrin 2 與胰腺癌之間存在密切相關(guān)性。緊接著，我們通過構(gòu)建不同Sestrin 2表達(dá)量的胰腺癌細(xì)胞模型，檢測在干預(yù)Sestrin 2 表達(dá)量的情況下，胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力變化。結(jié)果顯示，低表達(dá)Sestrin 2的CFPAC-1胰腺癌細(xì)胞和低表達(dá)Sestrin 2的PANC-1胰腺癌細(xì)胞均呈現(xiàn)較強的遷移能力（圖2A），而過表達(dá)Sestrin 2的相關(guān)胰腺癌細(xì)胞遷移能力降低（圖2B）。同時，通過Transwell侵襲試驗，結(jié)果顯示低表達(dá)Sestrin 2 的胰腺癌細(xì)胞侵襲能力增強（圖3A），而高表達(dá)Sestrin 2的胰腺癌細(xì)胞侵襲能力降低（圖3B）。綜上所述，Sestrin 2能抑制胰腺癌的轉(zhuǎn)移侵襲能力。

圖3 Sestrin 2調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞侵襲能力。分別對正常胰腺癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)染陽性慢病毒細(xì)胞的侵襲能力進行檢測，并在0 h和48 h進行拍攝（×400）。

圖2 Sestrin 2調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞遷移能力。分別對正常胰腺癌細(xì)胞、轉(zhuǎn)染對應(yīng)陰性慢病毒對照細(xì)胞和轉(zhuǎn)染陽性慢病毒細(xì)胞的劃痕遷移能力進行檢測，并在0 h和48 h進行拍攝（×80）。

2.3 Sestrin 2與胰腺癌細(xì)胞增殖能力密切相關(guān)

本研究通過動物皮下負(fù)瘤實驗檢測不同Sestrin 2 表達(dá)水平下胰腺癌細(xì)胞的增殖能力。通過構(gòu)建不同Sestrin 2表達(dá)量的CFPAC-1胰腺癌細(xì)胞和PANC-1胰腺癌細(xì)胞動物皮下負(fù)瘤模型，結(jié)果顯示，敲減Sestrin 2 后的胰腺癌細(xì)胞在裸鼠中生長增殖的腫瘤最大，而過表達(dá)Sestrin 2組別的瘤體較?。▓D4），這表明Sestrin 2能抑制胰腺癌的增殖。

圖4 Sestrin 2調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖能力。分別對CFPAC-1和PANC-1胰腺癌細(xì)胞進行Sestrin 2敲減與過表達(dá)，相應(yīng)模型細(xì)胞動物皮下負(fù)瘤實驗。

2.4 Sestrin 2與胰腺癌EMT密切相關(guān)

隨后我們深入探索Sestrin 2 和胰腺癌EMT之間的關(guān)系。我們通過在改變Sestrin 2 表達(dá)量的情況下，觀察E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和波形蛋白這三個EMT主要標(biāo)志物的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，當(dāng)Sestrin 2 表達(dá)量降低時，E-鈣黏蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)水平（圖5E，表2）和mRNA水平（圖5A，圖5B）均降低，而當(dāng)Sestrin 2過表達(dá)時，E-鈣黏蛋白表達(dá)水平升高（圖5C，圖5D，圖5F，表3）。相應(yīng)地，N-鈣黏蛋白和波形蛋白的相關(guān)表現(xiàn)與E-鈣黏蛋白呈相反的變化。這表明，Sestrin 2 在胰腺癌中起著抑制胰腺癌EMT進程的作用。

2.5 Sestrin 2在胰腺癌中可能通過mTOR信號通路調(diào)節(jié)EMT進程

以往的研究表明，PI3K-AKT-mTOR信號通路激活可觸發(fā)EMT過程，我們通過觀察mTOR信號通路的關(guān)鍵下游分子p70S6k表達(dá)量變化來觀察mTOR信號通路的變化。結(jié)果顯示，當(dāng)Sestrin 2表達(dá)量下調(diào)后，p70-s6k的表達(dá)水平升高（圖5A，圖5B，圖5E，表2），而當(dāng)Sestrin 2表達(dá)上調(diào)時，p70-s6k的表達(dá)水平下降（圖5C，圖5D，圖5F，表3）。Sestrin 2過表達(dá)時所得結(jié)果與Sestrin 2被敲減時的結(jié)果相反。因此，我們初步得出結(jié)論：Sestrin 2通過mTOR/p70s6k途徑調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的EMT進展。

表2 不同胰腺癌細(xì)胞Sestrin 2敲減模型中相應(yīng)指標(biāo)蛋白條帶灰度值變化（×10 000）

表3 不同胰腺癌細(xì)胞Sestrin 2過表達(dá)模型中相應(yīng)指標(biāo)蛋白條帶灰度值變化（×10 000）

3 討論

雖然目前對于胰腺癌的研究已經(jīng)較為深入，但關(guān)于胰腺癌的手術(shù)治療和化療的效果仍不甚滿意，其病死率仍居高不下[1-2]。在如胰腺癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展進程中，會有很多因素（如腫瘤微環(huán)境、miRNA、基因突變等）多方面地影響腫瘤的發(fā)展進程，因此通過深入研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制，進而從不同環(huán)節(jié)介入干預(yù)腫瘤的惡化進程，這將對腫瘤的相關(guān)治療產(chǎn)生巨大幫助[14-17]。本研究主要通過研究上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進程在胰腺癌中的作用來研究胰腺癌的生物學(xué)行為。

研究表明，EMT主要影響細(xì)胞的侵襲和遷移能力[18-20]，當(dāng)腫瘤細(xì)胞EMT進程得到促進，其癌癥細(xì)胞的轉(zhuǎn)運能力變強，進而在宏觀上表現(xiàn)為癌癥容易全身轉(zhuǎn)移擴散，從而加劇了腫瘤的治療難度[20-22]。相比較正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞的E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平降低，而N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)水平升高。因此，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，抑制或逆轉(zhuǎn)EMT進程對幫助腫瘤患者抑制疾病、治療疾病等均起著重要作用。

Sestrin 2 的表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，同時其能協(xié)同mTOR信號通路維持上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。然而Sestrin 2 在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中尚無相關(guān)研究。本研究通過構(gòu)建不同Sestrin 2 表達(dá)水平的人胰腺癌細(xì)胞模型，探索Sestrin 2與胰腺癌EMT之間的關(guān)系并觀察潛在的分子機制。我們發(fā)現(xiàn)，隨著Sestrin 2 表達(dá)水平的升高，胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力降低，增殖能力也被抑制，E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平升高，而N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)水平降低。基于上述結(jié)果，我們推測Sestrin 2可能通過抑制胰腺癌的EMT進程來抑制胰腺癌的惡性進程。

同時，mTOR信號通路作為腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的“明星”信號通路，其幾乎在所有腫瘤中表現(xiàn)為激活狀態(tài)[23-24]。而Sestrin 2作為mTORC1的抑制劑，對mTOR信號通路有著顯著的抑制作用。本研究顯示，隨著Sestrin 2表達(dá)水平的升高，mTOR信號通路的關(guān)鍵通路分子p70-s6k呈顯著抑制狀態(tài)。結(jié)合EMT的相關(guān)結(jié)論，我們推測，Sestrin 2通過抑制mTOR信號通路進而抑制胰腺癌EMT過程，從而達(dá)到抑制胰腺癌相關(guān)惡性生物學(xué)行為的作用。

本研究我們主要研究了Sestrin 2 在胰腺癌發(fā)生發(fā)展和EMT過程中所扮演的作用，了解了Sestrin 2起著抑制胰腺癌發(fā)生發(fā)展的作用。在胰腺癌的惡變過程中，Sestrin 2 的表達(dá)量被抑制，這導(dǎo)致胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為不被抑制，最終導(dǎo)致胰腺癌患者的極速惡化。假如我們能有效地定向誘導(dǎo)Sestrin 2表達(dá)，這將有效的抑制胰腺癌的惡化進程，故繼續(xù)深入研究Sestrin 2 在胰腺癌發(fā)生發(fā)展進程中的具體機制將對胰腺癌的相關(guān)靶向治療產(chǎn)生巨大的臨床應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

綜上所述，我們得出初步結(jié)論：Sestrin 2 可能通過抑制mTOR信號通路抑制胰腺癌EMT進程，從而起到抑制胰腺癌轉(zhuǎn)移侵襲等惡性生物學(xué)行為。本研究不僅建立了不同Sestrin 2 表達(dá)水平的胰腺癌細(xì)胞模型，更是豐富了Sestrin 2在胰腺癌EMT進程和mTOR信號通路中的相關(guān)研究。