肝臟疾病類器官模型的研究進(jìn)展

林允禎，王經(jīng)琳，任昊楨，施曉雷

（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 普外科，江蘇 南京 210008）

將胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）或來源于組織的干、祖細(xì)胞通過三維培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行體外培養(yǎng)獲得的細(xì)胞簇被稱為類器官[1]。類器官相較于傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)及動物模型試驗(yàn)有著獨(dú)到的優(yōu)勢，隨著細(xì)胞外基質(zhì)研究的加深以及新型支架材料的出現(xiàn)，體外三維培養(yǎng)能夠更加接近細(xì)胞在體內(nèi)生活的環(huán)境。同時(shí)，類器官無需面臨傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)動物研究中存在的物種差異問題。目前關(guān)于胃[2]、腦[3]、肝臟[4-5]等多種器官體外類器官構(gòu)建已相繼有報(bào)道。除此之外，類器官還可應(yīng)用于模擬腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展[6-7]以及藥物敏感性的檢測等研究[6，8]。

肝臟是人體內(nèi)最大的代謝器官，可以合成膽汁、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，同時(shí)在免疫、代謝、凝血等多方面都發(fā)揮功能，研究肝臟的生理及病理狀態(tài)有重要意義。傳統(tǒng)的研究方式是通過肝細(xì)胞體外培養(yǎng)以及小鼠模型實(shí)現(xiàn)，隨著原代肝細(xì)胞獲取難度大、體外培養(yǎng)增值能力差且細(xì)胞極性不能長期維持等問題的暴露，傳統(tǒng)培養(yǎng)模式不能滿足肝臟實(shí)驗(yàn)的需求，肝臟類器官的出現(xiàn)較好彌補(bǔ)了其不足。目前肝臟類器官可以應(yīng)用于構(gòu)建正常肝臟模型，并且具有形成肝臟內(nèi)復(fù)雜管道結(jié)構(gòu)的能力[5，8-9]，同時(shí)也可應(yīng)用于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染[7，10]、肝癌發(fā)生發(fā)展[6，11]等肝臟疾病相關(guān)的研究。本文主要闡述肝臟類器官構(gòu)建的方式以及類器官在肝臟疾病中的應(yīng)用。

1 類器官的構(gòu)建

1.1 細(xì)胞的選擇

理想的構(gòu)成類器官的細(xì)胞需要具備自我更新的能力，以及能夠被誘導(dǎo)分化成為其他不同類型的細(xì)胞?；诖?，ESCs、iPSCs，來源于組織器官的干、祖細(xì)胞則常被選擇成為構(gòu)建類器官較為常見的種子細(xì)胞。

ESCs多取自囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，分化潛能較高，并且由于早期缺乏表觀遺傳，組織相容性抗原不表達(dá)，因此不存在排斥反應(yīng)，可以進(jìn)行異體移植，理論上是構(gòu)建類器官較為理想的材料。日本科學(xué)家山中伸彌通過將四種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入已分化的體細(xì)胞，使其發(fā)生重編程，重新轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹只瘽撃艿膇PSCs[12]，而對重新獲得分化潛能的細(xì)胞可再次進(jìn)行誘導(dǎo)分化，獲得滿足需求的細(xì)胞。由于誘導(dǎo)iPSCs來源不涉及胚胎，倫理爭議較小，目前在研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[13]。而來源于組織器官的干、祖細(xì)胞培養(yǎng)方式相對便捷，能誘導(dǎo)分化成為特定組織來源的細(xì)胞，針對性較強(qiáng)[14]。

盡管理論上存在著多種選擇，但是不同細(xì)胞仍有其局限性所在，ESCs不能排除可能存在的致畸風(fēng)險(xiǎn)，且需要面臨倫理爭議等問題[13，15]。體細(xì)胞在經(jīng)歷重編程時(shí)有可能造成基因組穩(wěn)定性發(fā)生變化，并且由于存在表觀遺傳修飾，iPSCs在針對肝癌等表觀遺傳機(jī)制發(fā)揮重要作用的疾病的應(yīng)用仍需要進(jìn)一步討論[1]。成體干、祖細(xì)胞面對的問題則是細(xì)胞分化面窄，僅能分化成為與來源組織較為接近的一種或幾種細(xì)胞。對于類器官種子細(xì)胞的選擇，仍需要考慮到實(shí)驗(yàn)需求以及細(xì)胞限制等諸多問題。

1.2 培養(yǎng)結(jié)合載體

三維培養(yǎng)過程中，“細(xì)胞基質(zhì)”與“細(xì)胞溝通”發(fā)揮重要作用[16]，支架能夠提供適合細(xì)胞生長的微觀結(jié)構(gòu)。理想的細(xì)胞支架可以促進(jìn)細(xì)胞生長與黏附，包含維持細(xì)胞活力的營養(yǎng)環(huán)境，并且生物降解速率與細(xì)胞在新環(huán)境中基質(zhì)沉積速率相類似[13]。

根據(jù)支架來源不同可分為合成聚合物支架與生物聚合物支架，前者有較成熟的合成工藝，機(jī)械強(qiáng)度高，價(jià)格低廉；而生物聚合支架具有較好的生物活性，能夠更好促進(jìn)細(xì)胞和組織之間的相互作用[17]。目前脫細(xì)胞支架，水凝膠等細(xì)胞支架已經(jīng)應(yīng)用于各類三維培養(yǎng)系統(tǒng)中。脫細(xì)胞支架是指利用洗滌劑或酶制劑將離體組織器官內(nèi)細(xì)胞除去，同時(shí)保留器官基本外形、管道結(jié)構(gòu)、胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子等[18]。由于細(xì)胞生活環(huán)境動態(tài)多變，目前模擬培養(yǎng)環(huán)境仍不能完全反映真實(shí)的人體內(nèi)環(huán)境，脫細(xì)胞支架在這一方面具有天然優(yōu)勢，能夠極大程度保留細(xì)胞生長環(huán)境中的各種組分，同時(shí)提供管道結(jié)構(gòu)用于支撐以及物質(zhì)的傳遞。天然的水凝膠可以從膠原蛋白、纖維蛋白、殼聚糖等聚合材料中獲得，含水量高，生物相容性和天然組織類似，毒性較低，種植在水凝膠中的細(xì)胞可均勻分布在水凝膠各處。在起到支撐作用的同時(shí)，可溶性的細(xì)胞因子還可通過水凝膠向細(xì)胞傳遞。目前，水凝膠支架材料已廣泛應(yīng)用于骨、軟骨、血管等組織工程[13]。隨著材料學(xué)、3D打印技術(shù)等的發(fā)展，新型支架也不斷出現(xiàn)。聚乳酸、聚乙二醇、聚己內(nèi)酯等材料已經(jīng)應(yīng)用于支架的合成，Ng SS 等[16]利用聚乙二醇丙烯酸酯用于膽管類器官構(gòu)建。而另一種新型聚合材料支架，聚（3-羥基丁酸-3-羥基戊酸-3-羥基己酸）[Poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-3-hydroxyhexanoate），PHBVHHx]支架在電鏡下可觀察到不同孔徑的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，隨著溫度的調(diào)整可以改變孔徑的大小，基于此構(gòu)建的肝臟類器官對于肝衰竭小鼠有較好的治療效果[15]。石墨烯具有疏松多孔的特性，便于氧氣的運(yùn)輸，同時(shí)機(jī)械強(qiáng)度大，生物降解性良好，以石墨烯為材料的 支架已經(jīng)在心臟、軟骨、神經(jīng)元等組織工程中取得了一定成果[19]。單純的合成支架缺乏促進(jìn)細(xì)胞粘附、生長的條件，往往需要在支架表面涂布細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，相較于層黏蛋白，纖連蛋白等其他常見細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，I型膠原能夠更好促進(jìn)細(xì)胞粘附在支架上并且進(jìn)行增殖，是合成支架中較為常見的表面涂布材料[16，20]。綜上，細(xì)胞支架的選擇依賴于類器官構(gòu)建的功能需求。

1.3 細(xì)胞因子及共培養(yǎng)

類器官培養(yǎng)過程中需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求不斷改變培養(yǎng)基條件，可以引入不同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行增殖或者定向分化。類器官構(gòu)建早期階段，需要誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，獲得足夠的細(xì)胞量以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞培養(yǎng)基中引入表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、Wnt信號通路相關(guān)調(diào)節(jié)因子如Wnt3A、R-spondin 1（RSPO1）可有效促進(jìn)細(xì)胞增殖。之后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行定向分化，引入骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP），地塞米松等細(xì)胞因子可將增殖的細(xì)胞向肝細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化[21-22]，HGF、EGF、FGF、RSPO1等因子的引入可以使細(xì)胞在體外擴(kuò)增數(shù)個(gè)月，且細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)肝和膽管相關(guān)的標(biāo)志物，進(jìn)一步在培養(yǎng)基中引入BMP與地塞米松之后，可以觀察到白蛋白（albumin，ALB）、α1-抗胰蛋白酶等肝細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的提升，提示加入的誘導(dǎo)因子促進(jìn)增值的細(xì)胞向肝細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化[22]。改變誘導(dǎo)條件，在分化培養(yǎng)基中加入一定量mTeSR培養(yǎng)基則可將增殖細(xì)胞向膽管細(xì)胞方向誘導(dǎo)[5]。

除了引入特定的細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行分化以外，還可以通過細(xì)胞共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)細(xì)胞分化，將間充質(zhì)干細(xì)胞與肝細(xì)胞共培養(yǎng)4 周可獲得具有肝細(xì)胞功能的肝樣細(xì)胞，而肝細(xì)胞損傷后釋放的細(xì)胞因子也可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化[15]。共培養(yǎng)不僅提供了細(xì)胞生長分化所需的細(xì)胞因子，同時(shí)也促進(jìn)類器官的形成與復(fù)雜結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，星狀細(xì)胞與肝細(xì)胞共培養(yǎng)過程中，肝細(xì)胞聚集在星狀細(xì)胞周圍形成細(xì)胞團(tuán)塊，而進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)的肝細(xì)胞大多以散在形式存在[20]。iPSCs、內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞的共培養(yǎng)能夠誘導(dǎo)肝芽組織形成并且能夠快速血管化，復(fù)雜管道結(jié)構(gòu)能夠進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)胞因子及代謝廢物的傳遞，對較大體積類器官的構(gòu)建、研究發(fā)生于內(nèi)皮層面的生理病理過程等方面有著重要意義[8，23-24]。

2 不同肝臟類器官的構(gòu)建

2.1 正常肝臟類器官

肝臟有較強(qiáng)的再生能力，當(dāng)肝臟發(fā)生損傷時(shí)，門靜脈周圍的肝細(xì)胞能夠及時(shí)修復(fù)肝臟，而在有毒物質(zhì)作用于肝臟細(xì)胞時(shí)，膽管周圍細(xì)胞會擴(kuò)增用于肝臟的修復(fù)，但損傷修復(fù)面臨著閾值以及時(shí)間的限制。急性肝衰竭發(fā)生時(shí)，肝移植是目前唯一有效的治療方法，但肝源短缺限制了肝移植療法的臨床應(yīng)用價(jià)值。體外培養(yǎng)肝細(xì)胞則需要面臨獲取難度較高、原代肝細(xì)胞體外增值能力有限、長期培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)功能喪失等問題[20]。肝類器官由于體外培養(yǎng)過程中能夠維持干性以及表現(xiàn)出特定器官的功能，作為肝移植替代療法具有較大的應(yīng)用前景。同時(shí)肝類器官能夠彌補(bǔ)經(jīng)典模型在肝臟代謝研究方面的局限，用于研究肝臟損傷、藥物代謝及毒性反應(yīng)。

肝臟類器官的構(gòu)建通常需要擴(kuò)增與分化兩步，通過改變培養(yǎng)基的條件實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的擴(kuò)增或者定向分化，通過引入細(xì)胞因子擴(kuò)增細(xì)胞并誘導(dǎo)分化至內(nèi)胚層階段，后根據(jù)需要進(jìn)一步將其誘導(dǎo)成肝細(xì)胞[8-9，22]。除了引入特定的細(xì)胞因子以外，也可通過改變培養(yǎng)的條件誘導(dǎo)細(xì)胞分化，Mun SJ等[8]發(fā)現(xiàn)構(gòu)建缺氧環(huán)境同樣可以促進(jìn)內(nèi)胚層細(xì)胞向肝類器官分化。

正常肝臟除了肝細(xì)胞外，膽道系統(tǒng)也是肝臟組成的重要部分，肝細(xì)胞由內(nèi)胚層分化而來，而膽管上皮細(xì)胞由中胚層分化，通過引入FGF、激活素A（Activin A）等因子，將誘導(dǎo)至內(nèi)胚層的細(xì)胞進(jìn)一步誘導(dǎo)至中胚層，并在膽管細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)成為膽管類器官[5]。Wang S等[21]擴(kuò)增ESCs并通過流式細(xì)胞術(shù)分選出上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EPCAM）陽性的細(xì)胞，導(dǎo)入誘導(dǎo)因子培養(yǎng)兩周后，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形成空心管樣結(jié)構(gòu)，同時(shí)膽管細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）、EPCAM、γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶（gamma glutamyl transferase，GGT）等表達(dá)上調(diào)，肝細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物如甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、TBox3（TBX3）等表達(dá)下調(diào)，羅丹明123（rhodamine 123，Rho123）代謝實(shí)驗(yàn)檢測膽管標(biāo)志物多耐藥相關(guān)蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）提示陽性，表明類器官中具有較為成熟的膽管結(jié)構(gòu)。

關(guān)于肝類器官或者膽管類器官的培養(yǎng)方法已有不同團(tuán)隊(duì)相繼報(bào)道，但是如何在培養(yǎng)的組織器官中共同表達(dá)肝細(xì)胞與血管、膽管等復(fù)雜結(jié)構(gòu)仍是目前需要解決的問題。有研究發(fā)現(xiàn)mTeSR培養(yǎng)基可能影響NOTCH和TGF-β信號通路影響肝類器官的分化過程，在將iPSCs誘導(dǎo)至內(nèi)胚層階段后，向培養(yǎng)基中加入25% mTeSR培養(yǎng)基促進(jìn)部分內(nèi)胚層細(xì)胞向中胚層轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞成熟可培養(yǎng)同時(shí)表達(dá)肝細(xì)胞與膽管結(jié)構(gòu)的類器官[5]。

正常肝類器官獲取簡單，體外擴(kuò)增便捷，能夠長期保持細(xì)胞極性及功能，在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用中有廣泛前景，目前，針對藥物代謝以及肝損傷后類器官治療已有部分研究報(bào)道[25-26]。在臨床前實(shí)驗(yàn)中，對豬進(jìn)行85%肝切除構(gòu)建肝衰竭模型后，通過三維培養(yǎng)豬肝細(xì)胞進(jìn)行治療，大部分治療組的豬存活時(shí)間超過90 h，且體內(nèi)代謝廢物堆積水平明顯低于對照組，而對照組存活時(shí)間在30～50 h，肝切除48 h后檢測肝臟體積發(fā)現(xiàn)肝臟體積部分恢復(fù)，增殖相關(guān)標(biāo)志物Ki-67表達(dá)上升[27]。而另一項(xiàng)關(guān)于靈長類動物實(shí)驗(yàn)中也觀測到了類似的結(jié)果，利用α-鵝膏蕈堿及脂多糖處理30只恒河猴構(gòu)建急性肝衰竭模型后，在豬肝類器官為基礎(chǔ)的生物人工肝治療下，恒河猴存活率明顯提升，且免疫排斥反應(yīng)弱，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素12（interleukin-12，IL-12）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等因子水平降低，炎性細(xì)胞在治療后逐漸下降到正常水平，增殖相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)上升，肝臟損傷狀況得到了明顯改善[28]。

2.2 脂肪肝類器官

脂肪肝是常見的代謝性疾病，根據(jù)發(fā)病因素的不同可以分為酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝，隨著肝細(xì)胞脂肪變程度的加深，肝臟結(jié)構(gòu)及功能受損，可進(jìn)一步導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)改變，引發(fā)肝炎、肝纖維化甚至肝硬化。將胎兒間充質(zhì)細(xì)胞和ESCs共培養(yǎng)，構(gòu)建的類器官可表達(dá)乙醇代謝相關(guān)酶如乙醇脫氫酶以及細(xì)胞色素P450超家族（cytochrome P450 proteins，CYP）成員CYP2E1，進(jìn)一步使用乙醇處理類器官后，肝損傷標(biāo)志物表達(dá)上升，并出現(xiàn)肝脂肪變性、纖維化、線粒體膜電位去極化等與乙醇肝損傷相似表現(xiàn)[21]。非酒精性脂肪肝受到多種因素調(diào)控，目前仍未完全闡明其發(fā)病機(jī)制，研究疾病的發(fā)生及發(fā)展有較大意義。肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞在肝纖維化過程中發(fā)揮著重要作用，將肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)形成的肝類器官置于含有脂肪酸、棕櫚酸、油酸的混合培養(yǎng)基中可以誘導(dǎo)脂質(zhì)堆積以及膠原分泌，而抗脂肪變性和抗纖維化的藥物如奧貝膽酸可減輕癥狀[29-30]。除代謝環(huán)境的影響外，相關(guān)基因的表達(dá)異常也可導(dǎo)致肝脂肪變性。小干擾RNA 122（microRNA-122，miR-122）在抑制炎癥、壞死、脂肪變性方面有調(diào)控作用，在肝細(xì)胞和星狀細(xì)胞共同構(gòu)建的類器官中，抑制miR-122 可導(dǎo)致趨化因子配體2（chemokine ligand 2，CCL2）、趨化因子配體3（chemokine ligand 3，CCL3）、TNF-α、IL-6等炎性因子表達(dá)的上升，同時(shí)細(xì)胞發(fā)生脂肪變性和纖維化[31]。肝脂肪變性及纖維化受到遺傳信號、代謝環(huán)境等多種因素的控制，類器官可為疾病研究提供一種便捷、可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。目前脂肪肝類器官?yīng)用于藥物代謝模型較多，臨床前研究及臨床試驗(yàn)尚無報(bào)道。

2.3 乙肝類器官

目前中國仍是乙肝大國，HBV感染導(dǎo)致的肝硬化乃至肝癌仍是影響國人生命安全的主要因素之一。HBV感染存在明顯異質(zhì)性，部分人可表現(xiàn)為有限或者無癥狀的感染，而部分人則會發(fā)展成肝硬化甚至肝癌。經(jīng)典二維細(xì)胞培養(yǎng)模式除了要面對細(xì)胞來源缺乏以及不能較好模擬體內(nèi)環(huán)境的問題外，有限的增殖能力也導(dǎo)致病毒相關(guān)的遺傳修飾不能保存，為進(jìn)一步研究增加了困難[10]。類器官在長期保存、體外增殖、模擬細(xì)胞與組織器官間相互作用等方面具有優(yōu)勢，可以構(gòu)建體外長期保存的HBV感染模型。

通過病毒感染類器官，感染相關(guān)蛋白的表達(dá)是關(guān)鍵，牛磺膽酸鈉轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）可能是HBV侵入細(xì)胞的關(guān)鍵受體之一，有研究表明，在肝癌細(xì)胞系中過表達(dá)NTCP容易導(dǎo)致HBV的感染，并且已有團(tuán)隊(duì)通過HCV感染肝癌細(xì)胞系得到HCV感染模型[32]，但是相比于正常細(xì)胞系，肝癌細(xì)胞系中包括先天性免疫在內(nèi)的多條引號通路缺失，這對病毒感染機(jī)制的研究造成一定影響[10]。合適的細(xì)胞則是成功構(gòu)筑病毒感染模型的另一項(xiàng)要素，iPSCs具有較好的增值能力及分化潛能，是病毒感染類器官的良好細(xì)胞選擇。Ng SS等[16]利用反相聚乙二醇支架培養(yǎng)iPSCs構(gòu)建類器官，可表達(dá)與病毒侵襲及包裝的相關(guān)蛋白，進(jìn)一步利用病毒感染類器官構(gòu)建病毒類器官模型。Kaneko S等[10]構(gòu)建了由肝祖樣細(xì)胞（induced pluripotent stem cell-derived hepatic progenitor cells，iPSHPCs）和分化肝樣細(xì)胞（induced pluripotent stem-cellderived hepatocytes，iPS-Heps）兩種不同細(xì)胞來源的感染類器官，Nie YZ等[7]利用iPSCs、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)構(gòu)建肝類器官，通過HBV感染成功構(gòu)建乙肝類器官。由iPSCs構(gòu)建的乙肝類器官能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)模型的不足，同時(shí)具備較完備的信號通路，能夠滿足對于HBV感染機(jī)體的研究，并可進(jìn)一步針對其信號通路研究治療藥物及方法。

2.4 肝癌類器官

原發(fā)性肝癌是致死性惡性腫瘤之一，隨著生活水平質(zhì)量的提高，糖尿病、肥胖等危險(xiǎn)因素增加，肝癌的發(fā)病率也在逐年上升。全基因組測序發(fā)現(xiàn)了肝癌患者存在大量基因突變，這對于人類理解肝癌的發(fā)生起到了很大幫助。然而，肝癌具體發(fā)生機(jī)制仍未完全闡明，傳統(tǒng)二維培養(yǎng)模式下的腫瘤細(xì)胞無法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與周圍環(huán)境間相互交流的過程，通過三維培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞可以更準(zhǔn)確展現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞對腫瘤微環(huán)境的構(gòu)建，反映出腫瘤發(fā)生過程中的真實(shí)過程，對腫瘤治療靶點(diǎn)及藥物篩選可起到一定指導(dǎo)作用[33-34]。

有研究團(tuán)隊(duì)篩選肝細(xì)胞肝癌及膽管細(xì)胞癌高突變基因并在構(gòu)建的肝類器官中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)肝癌高突變基因c-myc的表達(dá)導(dǎo)致組細(xì)胞形態(tài)更加無序，ALB表達(dá)下降，將類器官移植入實(shí)驗(yàn)小鼠后發(fā)現(xiàn)小鼠形成肝癌，而誘導(dǎo)膽管細(xì)胞癌高突變基因RASG12V在類器官中的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形成黏液空泡樣，SOX9、CK19 等膽管細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，提示該肝細(xì)胞向膽管細(xì)胞癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化[11]。將來源于肝細(xì)胞肝癌、膽管細(xì)胞性肝癌、膽管細(xì)胞癌的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行三維擴(kuò)增培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)物形態(tài)，相比于健康肝類器官，腫瘤類器官表現(xiàn)出更加不規(guī)則的形態(tài)結(jié)構(gòu)，肝癌標(biāo)志物AFP和磷脂酰肌醇聚糖3（Gypican-3，GPC3）明顯上升，而ALB、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）、載脂蛋白A1（apolipoprotein A1，APOA1）、載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）等肝臟標(biāo)志物隨著腫瘤來源的不同表達(dá)也存在差異，而不同來源的肝癌類器官對不同腫瘤藥物的敏感性也有所不同，提示肝癌類器官在體外培養(yǎng)的條件下仍能保持和來源組織相同的性質(zhì)[6]。體外培養(yǎng)的肝癌類器官能夠保持高增殖能力的同時(shí)保持原有腫瘤的性質(zhì)，為腫瘤研究提供了一個(gè)簡便、穩(wěn)定、可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

3 小結(jié)與展望

類器官可以在極大程度上彌補(bǔ)傳統(tǒng)研究方法上的不足，對于模擬肝臟的發(fā)生、損傷修復(fù)、疾病與機(jī)體相互作用、藥物篩選等方面可以發(fā)揮重要作用。目前肝臟類器官在基礎(chǔ)研究中已有一定研究基礎(chǔ)，但是類器官的臨床應(yīng)用仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)，距離完全成熟的人工肝臟仍有較長距離，對于復(fù)雜血管、膽管等的模擬仍然無法完美實(shí)現(xiàn)。目前類器官仍有較大的進(jìn)步空間，在生命科學(xué)研究上有巨大的應(yīng)用前景。隨著材料學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，相信相關(guān)問題會逐步被攻克，類器官會廣泛應(yīng)用于科研及臨床的各個(gè)方面。