熱暴露對大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞鐘基因BMAL1 和細(xì)胞周期蛋白的影響

張瀚文 ， 耿 瑤 ， 常笑語 ， 穆 樂 ， 楊春麗 ， 武曉敏 ， 李光華 ，

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，銀川 750004）

應(yīng)激是機體在各種內(nèi)外環(huán)境因素及社會、心理因素刺激后所做出的一系列非特異性生理反應(yīng)的總和。長時間處于高溫環(huán)境，可引起全身的非特異性適應(yīng)反應(yīng)，從而引起各種病理生理學(xué)變化。熱應(yīng)激可導(dǎo)致大鼠小腸發(fā)生病理性損傷、晝夜節(jié)律相關(guān)基因mRNA 表達(dá)異常，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致血管損傷，影響心血管功能[1]。許多重要的細(xì)胞周期基因，如 p53、p21、wee1、c-myc、cyclind1 等都是鐘控基因，其表達(dá)受鐘基因調(diào)控，具有晝夜節(jié)律性。細(xì)胞周期正常有序的運轉(zhuǎn)過程受到許多細(xì)胞周期基因和其產(chǎn)物的調(diào)控，這些調(diào)控因子構(gòu)成了一個復(fù)雜且有序的分子網(wǎng)絡(luò)，監(jiān)管著細(xì)胞周期進(jìn)程有序運轉(zhuǎn)，以確保細(xì)胞增殖和凋亡的平衡。當(dāng)這些細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)因子發(fā)生異常和改變時，導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，繼而使細(xì)胞增殖和凋亡平衡失控最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生[2-6]。生物鐘和細(xì)胞周期之間存在緊密的雙向相位耦合[7]。研究[8-9]表明，鐘基因在人類口腔黏膜和皮膚中的表達(dá)與特定的細(xì)胞周期時相有關(guān)，CyclinB1 基因Cnnb1 的峰值表達(dá)與BMAL1 鐘基因的峰值一致，而PER1 的轉(zhuǎn)錄與P53 mRNA 水平的峰值在G1 晚期一致。為探討長時間熱暴露對動物晝夜節(jié)律及細(xì)胞周期潛在的影響，本文對大鼠熱暴露后胸主動脈和內(nèi)皮細(xì)胞晝夜節(jié)律相關(guān)基因 BMAL1 和細(xì)胞周期蛋白 CDK1、CDK4、CDK6、CyclinB1 表達(dá)進(jìn)行研究，進(jìn)一步探討此現(xiàn)象發(fā)生的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細(xì)胞、試劑及儀器

選用健康雄性SD 大鼠20 只，體質(zhì)量180～220 g。所有大鼠每日自由進(jìn)食［動物及飼料均由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，倫理號：寧醫(yī)大倫理第 2020-326 號；許可證號：SCXK（寧）2015-0001］，并給予充足的純凈水飲用，分籠飼養(yǎng)，每籠5 只，光照明暗周期為12 h/12 h，即每天6:00～18:00 為暗，18:00～次日 6:00 為明，環(huán)境溫度（24±0.1）℃。體外實驗，選用大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞株（RTAEC），購自上海賽齊生物工程有限公司，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。

WB 一抗：BMAL1（貨號：DF10308-200；美國Affinity Biosciences 公司），CyclinB1（貨號：#4138；Cell Signaling Technology 公司），CDK1（貨號：bs-0542R；北京博奧森生物技術(shù)有限公司），CDK4（貨號：11026-1-AP）、CDK6（貨號：14052-1-AP）均購自美國 Proteintech Group 公司，WB二抗：辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（貨號：ZB-2305）、β-Actin（貨號：TA-09）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Goat Anti-rabbit IgG/HRP（貨號：bs-0259G-HRP；北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、BCA 蛋白含量檢測試劑盒、全蛋白提取試劑盒（KeyGEN BioTECH），光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司），人工氣候艙、酶標(biāo)儀、4 ℃離心機、超凈工作臺、37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾科技有限公司），電泳儀、電泳槽（美國Bio-Rad 公司），震蕩混懸器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），-80 ℃冰箱、-150 ℃超低溫冰箱（美國-紐艾爾公司），化學(xué)發(fā)光成像儀（美國通用電氣公司），細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國 Corning 公司）。

1.2 實驗動物的分組和干預(yù)方法

將20 只SD 大鼠，隨機分為正常對照組和熱暴露組各10 只，環(huán)境溫度為24 ℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周；開始模型制備；正常對照組，大鼠飼養(yǎng)在24 ℃溫度環(huán)境中；熱暴露組大鼠飼養(yǎng)在32 ℃溫度環(huán)境中；兩組飼養(yǎng)環(huán)境相對濕度均為（32±4.3）%，干預(yù)過程中，每3 d 進(jìn)行1 次體質(zhì)量測量并記錄，持續(xù)時間為14 d。兩組大鼠分別干預(yù)14 d 后，在取材前夜禁食，自由飲水；取材前對大鼠進(jìn)行稱重，戊巴比妥鈉配制成1%生理鹽水溶液腹腔注射對大鼠進(jìn)行麻醉，給藥容積一般為5～10 mg·kg-1，麻醉完成后，將大鼠固定于解剖臺上，暴露大鼠的整個胸部和腹部，修剪去腹部毛發(fā)，75%乙醇消毒。從劍突向上剪開皮膚至頜下，向兩側(cè)鈍性分開皮膚與皮下組織，暴露胸廓及頸淺肌層；沿正中剪開胸廓、胸膜，避免損傷胸腺的胸腔器官。暴露心臟，分離其他器官組織，沿著心臟主動脈弓在大鼠胸腔后壁脊柱側(cè)分離胸主動脈，用止血鉗夾住胸主動脈上下端，眼科剪剪取胸主動脈，置于生理鹽水反復(fù)涮洗去除血管中的血液，剪成數(shù)段分別進(jìn)行組織固定及凍存，以備后續(xù)實驗使用。

1.3 大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和處理

復(fù)蘇胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞株，待其穩(wěn)定生長，進(jìn)入對數(shù)生長期，對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)；對照組置37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，熱暴露組置 40 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，用含10%新生牛血清以及青鏈霉素各100 U·mL-1的 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng) 24 h。

1.4 HE 染色觀察熱暴露大鼠胸主動脈血管形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

取新鮮的大鼠胸主動脈血管浸泡在4%的多聚甲醛液中固定24 h，自來水沖洗2 h，70%乙醇中過夜。次日，從75%乙醇撈出組織包埋盒，分別經(jīng)過80%、90%、95%乙醇2 h、無水乙醇Ⅰ30 min、無水乙醇Ⅱ30 min 依次進(jìn)行組織脫水。組織包埋盒從無水乙醇中取出，去掉多余乙醇，放入盛有新鮮二甲苯的容器Ⅰ和Ⅱ中各30 min。浸蠟、包埋、切片、脫蠟、脫水、蘇木素溶液中進(jìn)行細(xì)胞核的染色、0.5%分化液中（成分：75%乙醇和濃鹽酸）分化、伊紅染色、滴加中性樹脂，封片進(jìn)行后續(xù)拍片觀察。

1.5 免疫組織化學(xué)染色檢測熱暴露大鼠胸主動脈BMAL1 蛋白表達(dá)

將制成蠟塊的大鼠胸主動脈血管進(jìn)行組織切片，將組織切片迅速放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ脫去組織中的蠟，脫水，高溫抗原修復(fù)，37 ℃溫箱內(nèi)孵育15 min；用PBS 清洗；滴加正常用山羊血清放入濕盒內(nèi)，37 ℃溫箱封閉1 h。滴加一抗置于濕盒內(nèi)，4 ℃過夜，37 ℃復(fù)溫 1～2 h，PBS 清洗；甩干滴加反應(yīng)增強液，37 ℃孵育20 min；PBS 清洗，滴加相應(yīng)二抗，37 ℃孵育 1 h；PBS 清洗 3 次，進(jìn)行DAB 顯色，去離子水中清洗3～5 min，滴加蘇木素染色液中染核2 min；去離子水中清洗，置于0.5%分化液中（成分：75%乙醇和濃鹽酸）分化5 s，變色即撈出，放入水中清洗，清洗結(jié)束后依次經(jīng)50%、75%、80%、90%、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各30 s；最后轉(zhuǎn)入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各2～3 min；加一滴中性樹脂于組織中心，蓋上與載玻片相配套的蓋玻片，趕盡多余氣泡，放于室溫下晾干，進(jìn)行后續(xù)拍片觀察，用Image J軟件對目的蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計。

1.6 Western blot 檢測熱暴露大鼠胸主動脈血管組織和胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞BMAL1 及細(xì)胞周期蛋白 CDK1、CDK4、CDK6、CyclinB1 的表達(dá)

將制備的組織和細(xì)胞從－80 ℃冰箱取出，放冰上備用，提前配制組織和細(xì)胞裂解液，放置冰上預(yù)冷，組織蛋白提取需要提前用液氮將研缽預(yù)冷，將組織置于研缽中，研磨成組織粉末，并轉(zhuǎn)移至離心管中，根據(jù)組織重量大小，加入組織裂解液，充分震蕩混勻，離心，收集蛋白；細(xì)胞蛋白的提取則省去液氮研磨步驟，直接將配制好的細(xì)胞蛋白裂解液根據(jù)細(xì)胞數(shù)加入細(xì)胞，充分振蕩混勻，離心并收集蛋白，然后采用BCA 法進(jìn)行組織和細(xì)胞蛋白含量的測定。最后將蛋白變性后經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用含 5%脫脂奶粉的 TBST（Tris-Hcl 20 mmol·L-1，NaCl 137 mmol·L-1含 0.1% Tween-20）封閉 1 h，用特異性Western blot 目的蛋白一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次，每次5 min，相應(yīng)的二抗孵育1 h，TBST 洗滌 3 次，每次 5 min，配制超敏發(fā)光液：將超敏發(fā)光液試劑盒中的A 液和B 液按1∶1比例配制，每張膜200 μL 的用量按照實際情況配制；發(fā)光；用Image J 軟件進(jìn)行目的條帶灰度值分析，GraPhPad Prism6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析并作圖。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件和GraPhPad Prism6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。滿足正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)取 α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 熱暴露對大鼠體質(zhì)量的影響

隨著時間的變化，兩組大鼠的體質(zhì)量均呈上升的趨勢，相同時間點兩組大鼠體質(zhì)量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞0.05），見表 1。

表1 熱暴露對大鼠體質(zhì)量的影響（，g）

表1 熱暴露對大鼠體質(zhì)量的影響（，g）

組別 n 第3 天 第6 天 第9 天 第12 天 第15 天正常對照組 10 310.26±6.34 313.32±7.69 319.34±7.04 325.07±9.43 333.14±7.69熱暴露組 10 315.03±7.76 317.63±6.72 318.29±8.73 320.14±8.06 323.61±8.23 t 值 1.505 1.335 0.296 1.257 2.676 P 值 0.1496 0.1986 0.7706 0.2249 0.0154

2.2 熱暴露對大鼠胸主動脈血管形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

大鼠胸主動脈血管HE 染色結(jié)果顯示：正常對照組大鼠胸主動脈血管管壁完整，彈性纖維排列整齊；熱暴露組大鼠胸主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯缺失，彈性纖維排列紊亂，斷裂，不規(guī)則，見圖1。

圖1 熱暴露對大鼠胸主動脈血管形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響（HE×40）

2.3 免疫組織化學(xué)檢測熱暴露大鼠胸主動脈BMAL1 蛋白的表達(dá)情況

棕色顆粒為目的蛋白的表達(dá)，顏色越深代表目的蛋白表達(dá)越高，顆粒越多表明目的蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)目越多。與正常對照組比較，熱暴露組BMAL1 蛋白表達(dá)升高，陽性細(xì)胞數(shù)目增多（P＜0.001），見圖 2、圖 3。

圖2 熱暴露對大鼠胸主動脈血管BMAL1 蛋白表達(dá)的影響（IHC×40）

圖3 兩組大鼠胸主動脈血管BMAL1 蛋白表達(dá)情況

2.4 Western blot 檢測熱暴露大鼠胸主動脈血管BMAL1 及細(xì)胞周期蛋白 CDK1、CDK4、CDK6、CyclinB1 的表達(dá)情況

與對照組比較，熱暴露組大鼠胸主動脈血管BMAL1、CDK1、CyclinB1 蛋白表達(dá)均升高（P 均＜0.05），見圖 4。

2.5 Western blot 檢測大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞BMAL1 及細(xì)胞周期蛋白 CDK1、CDK4、CDK6、CyclinB1 的表達(dá)

與對照組比較，熱暴露組大鼠胸主動脈血管組織 BMAL1、CDK1、CyclinB1 蛋白表達(dá)均升高（P均＜0.01），見圖 5。

3 討論

課題組前期研究[10]表明，熱應(yīng)激可以使胸主動脈血管對去甲腎上腺素（NE）的收縮反應(yīng)性發(fā)生變化，因不同時間熱暴露引起的這種血管反應(yīng)性的變化，推測這種變化可能和鐘基因的調(diào)控機制相關(guān)，血管的收縮反應(yīng)改變可能與內(nèi)皮功能改變相關(guān)，其作用機制尚未明確。晝夜節(jié)律鐘是以24 h 周期組織細(xì)胞功能的自主計時機制。在哺乳動物中，主要的晝夜節(jié)律振蕩由轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)組成[11-13]。BMAL1 是核心鐘基因的關(guān)鍵元件，也是缺失后導(dǎo)致哺乳動物所有節(jié)律完全消失的惟一時鐘基因。鐘基因形成轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)，維持晝夜節(jié)律[13]。晝夜節(jié)律的紊亂可影響各種行為和生理功能增加各種疾病的風(fēng)險，當(dāng)這些晝夜節(jié)律振蕩器的功能被年齡環(huán)境或基因突變所擾亂時，細(xì)胞功能的時間協(xié)調(diào)性就失去了，這就降低了機體的健康和適應(yīng)能力，引起代謝綜合征和心血管疾病等。血管內(nèi)皮細(xì)胞（VECs）是位于心、血管和淋巴管內(nèi)表面的單層扁平上皮，具有多種生理功能。生物鐘功能障礙可引起內(nèi)皮功能障礙，內(nèi)皮功能障礙是導(dǎo)致心血管疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，心血管系統(tǒng)又受到晝夜節(jié)律分子成分的影響。

圖4 大鼠胸主動脈血管BMAL1 及細(xì)胞周期蛋白CDK1、CDK4、CDK6、CyclinB1 的表達(dá)情況

圖5 大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞BMAL1 及細(xì)胞周期蛋白CDK1、CDK4、CDK6、CyclinB1 的表達(dá)情況

細(xì)胞周期表現(xiàn)為一個振蕩器，細(xì)胞周期蛋白的循環(huán)表達(dá)以順序和單向的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程[14]。細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞周期的特定階段產(chǎn)生，并與其各自組成性表達(dá)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合。細(xì)胞周期蛋白-CDK 復(fù)合物（Cyclin/CDK）的激酶活性在細(xì)胞周期的特定時間觸發(fā)各種事件[15]。各種Cyclin/CDK 復(fù)合物的數(shù)量和活性的振蕩對細(xì)胞周期進(jìn)程至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，熱暴露組胸主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯缺失，彈性纖維紊亂、斷裂；熱暴露組大鼠胸主動脈血管BMAL1 陽性表達(dá)增多；體內(nèi)實驗中，熱暴露組大鼠胸主動脈血管中BMAL1、CyclinB1、CDK1 蛋白表達(dá)升高；體外實驗，熱暴露組大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中 BMAL1、CyclinB1、CDK1 蛋白表達(dá)升高。由此推測，熱暴露可使鐘基因表達(dá)水平發(fā)生改變，也可以影響細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，且周期蛋白表達(dá)變化比較明顯，其中主要是調(diào)控G2/M 期的CyclinB1、CDK1。提示熱暴露可以引起大鼠胸主動脈內(nèi)皮損傷及組織結(jié)構(gòu)紊亂；大鼠胸主動脈及大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞鐘基因BMAL1 和細(xì)胞周期蛋白表達(dá)變化，其主要影響了G2/M 期主要蛋白的表達(dá)，對G1/S 期蛋白表達(dá)無影響，且在體內(nèi)外實驗結(jié)果呈現(xiàn)一致，提示熱暴露可以改變鐘基因的表達(dá)水平，從而影響周期蛋白表達(dá)水平，可能通過影響了鐘基因表達(dá)及G2/M 期蛋白表達(dá)來影響胸主動脈及內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

綜上，熱暴露可以引起大鼠胸主動脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)改變；大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞鐘基因BMAL1和細(xì)胞周期蛋白CyclinB1、CDK1 表達(dá)上調(diào)，提示熱暴露可以改變鐘基因與細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)水平，此變化可能是通過影響G2/M 期蛋白表達(dá)來實現(xiàn)的。